Penidiella sp. HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp. HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL。通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku。该酶反应的最适温度为60~70℃,最适pH值为3.0,在70℃以下及pH值2.0~8.0范围内均能保持稳定。Mn2+对酶有激活作用,而Na+对酶有抑制作用,其他金属离子对酶的活性影响不大。底物专一性实验表明,该酶可作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-NPGlu)、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-NPG)。作用于p-NPGlu和o-NPG的米氏常数(Km)值分别为0.434和0.411 mmol/L,酶促反应的最大速度(vmax)分别为1.0×10-3和3.3×10-4mol/(L.min)。     

思茅松等位酶实验方法及改进

以思茅松种子的胚乳为实验材料,探索了思茅松等位酶的实验方法.采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳与水平切片淀粉凝胶电泳相结合的方法,获得所试验的13种等位酶中AAT,ADH,EST,GDH,G6PD,MDH,PGD6,PGM和SKD等9种电泳效果良好的等位酶酶谱.通过两种电泳方法的有机结合,以及对制样及上样方法的改进,大大地提高了实验效率.本研究得到的等位酶酶谱式样,为下一步思茅松种群遗传分析提供了资料.     

产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究

[目的]采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数.[方法]以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌.利用ABTS[2,2 ′-连氮一双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ [4-羟基-3,5-二甲氧基一苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛.确定供试菌株后,利用形态观察结合rDNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种.以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量.在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始pH、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数.[结果]获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08.结合形态学特征与rDNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌.该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·mL-1.疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0％葡萄糖和3.5％蛋白胨,培养基初始pH7.0.最适装液量60 mL·(250 mL)-1,最适接种量4％,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1.没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好.经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·mL-1,比优化前提高了81.25％.[结论]建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-08.该菌株经单因素试验产酶条件优化效果明显,酶活水平提高显著,可为微生物发酵产漆酶提供新的菌株资源,在微生物发酵漆酶工业生产中具有应用潜力.后续对疣孢漆斑菌NF-08漆酶产生、性质及基因表达调控的深入研究,将有助于了解漆酶在半知真菌生活史中的作用及生态学功能,同时拓展半知真菌漆酶的应用领域.     

国产固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-ACA的工艺优化

通过对国产固定化GL-7-ACA酰化酶和游离酶的表观米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定.结果表明:固定化GL-7-ACA酰化酶的Km和Vm值分别为8.69 mm o l.L-1和76μm o l.g-1m i-n 1,均较游离酶高;在对酶促反应的关键参数底物质量浓度、转化温度、转化pH进行优化后,用固定化GL-7-ACA酰化酶在底物GL-7-ACA质量浓度30 g.L-1、转化温度25℃、转化pH 8.0的条件下转化GL-7-ACA制备7-ACA可连续操作150批以上,转化率和收率均达95%以上.     

黄芪鲨烯合酶基因的克隆和序列分析

参照豆科其他植物的鲨烯合酶基因序列设计了引物,通过逆转录PCR方法,从荚膜黄芪（Astragalus mem-branaceus（fish.）Bge）中克隆了鲨烯合酶基因cDNA序列（GenBank登录号HQ829974）。通过BLAST发现黄芪鲨烯合酶推测的氨基酸序列与大豆鲨烯合酶（BAA22559.1）序列相似性最高,达到了88%。黄芪鲨烯合酶的克隆为以后通过基因转化提高黄芪皂苷含量亦或通过生物工程手段生产黄芪皂苷打下基础。     

生物柴油催化剂固定化酶的性能评价及其动力学分析

通过正交试验优化了生物柴油催化剂固定化酶活力测定的最佳条件,比较了固定化酶与游离酶的性能,并对固定化酶催化反应的动力学进行了初步分析.结果表明：测定固定化酶活力的最佳条件为反应时间20min,温度43℃,固定化酶用量40mg;与游离酶比较,固定化酶最适反应温度提高,贮藏稳定性和操作稳定性都有大幅度提升;动力学分析结果表明,固定化酶催化反应的速率在动力学上是可以控制的.     

仙客来耐热性的生理研究——酶性和非酶性活性氧清除能力与耐热性

温度是影响植物生理过程的重要生态因子之一.植物体在生长发育过程中,经常会遭受到高温的胁迫,造成植物萎蔫甚至死亡,这与高温引起植物生理代谢的紊乱和细胞结构破坏有关.随着全球环境的恶化,植物对高温的反应日益受到人们的关注.植物在高温条件下,细胞内会产生过量的自由基,能引发膜脂过氧化作用,造成膜系统的伤害.超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等为防御膜脂过氧化的主要保护酶系统,抗坏血酸(AsA)是植物体内有效的抗氧化剂.它们通过不同的作用方式清除植物体内产生的活性氧,减弱氧化伤害.本研究以两个品种的仙客来为试验材料,比较研究两者在高温胁迫下其清除系统活性和含量的变化,从活性氧代谢来探讨仙客来耐热性的机理.     

漆树酶的固定化——Ⅰ聚丙烯酰胺包埋法固定化漆树酶

漆树酶(BC.1.10.3.2)从生漆中提取后,用聚丙烯酰胺包埋固定化。研究了固定化的条件,以及固定化漆树酶的重复使用性和耐热性,测定了它的米氏常数,并与天然漆树酶进行了比较。固定化漆树酶的活力回收可达30％;重复使用十多次后其活性还保留约80％;在干燥状态下,固定化漆树酶非常耐热。     

山核桃属植物种子中过氧化物酶活力

对山核桃属植物种子贮藏及萌发过程中过氧化物酶活力进行了研究,结果表明:山核桃属植物种子中过氧化物酶的活力均随着贮藏时间的延长而降低,低温条件下其酶活力下降较慢,室温条件下降较快;山核桃属植物种子整个萌发过程中,从发芽试验之日起至萌发高峰期,其酶活力逐日递增;自萌发高峰期至萌发停止,其酶活力又逐日递减,呈下降趋势;整个过程为一抛物线,呈显著相关.     

红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶的检测

木材白腐菌在分解木质素的过程中会产生非特异性的分解木质素结构的酶系统,这些酶系统主要包括细胞外过氧化物酶[锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)]和细胞外酚氧化酶[漆酶(laccase)].因此,在生物修复方面,白腐菌能够有效地降解废水和土壤中难被降解的多氯联苯、多环芳烃、DDT、染料、炸药和其他氯化物、叠氮化合物等.     

3种白腐菌木质素降解酶的比较

对3种白腐菌——黄孢原毛平革菌、变色栓菌和木质层孔菌在恒温振荡培养条件下产漆酶、锰过氧化物酶的情况进行比较研究,同时还对此3种菌在培养过程中还原糖的变化作了研究.结果表明:3种白腐菌中变色栓菌产漆酶相对最高,其漆酶酶活最高达到136.5 U/L,产酶最高时间为第8天;而木质层孔菌产锰过氧化物酶相对最高,其最高酶活达到880.2 U/L,产酶最高时间为第8天;同时在培养过程中还原糖含量随培养时间的延长而逐渐降低.     

热解糖梭菌β-木糖苷酶的克隆表达及其水解木二糖的应用

对来源于Thermoanacrobacterium thermosaccharolyticum的糖苷水解酶39家族的β-木糖苷酶基因Tt-xyl39进行了重组表达和酶学性质的研究,为新型β-木糖苷酶的研发及应用奠定基础.通过比对T.thermosaccharolyticum 571的全基因组序列,从中克隆出一个新型β-...     

以酶解渣为碳源制备木聚糖酶的研究

以里氏木霉（Tichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌，低聚木糖制备过程中酶解渣为碳源可透导产生含低纤维素酶活（0.106IU/mL)的木聚糖酶（154.67IU/mL)，两种酶活的比值达1459，与粗木聚糖为碳源产木聚糖酶相比，木聚糖酶活提高了1.67倍，而纤维素酶活没有增加。此酶在50℃条件下酶解粗木聚糖和酶解渣时，pH值5时酶解效率最高，酶解产物通过HPLC分析，主要是木糖。该酶系的组成主要是外切-β-木糖苷酶。     

刺槐群体等位酶分析

等位酶(allozyme)是同工酶的一种,是同一基因位点不同等位基因所编码的一种酶的不同形式,是结构基因编码的产物,遗传和表达遵循孟德尔定律.通过一定方式的电泳,从酶谱上可以分析、识别出编码它们的等位基因,再统计出各种等位基因频率和基因型频率,便可进一步计算出群体的各项遗传学参数,从而了解一个群体的遗传结构(王中仁,1996).对一个物种的遗传结构进行研究,有助于理解该物种的地理变异模式、遗传多样性等,并提供为该物种遗传资源保护、利用做出决策的重要信息(沈浩等,2001;金燕等,2003).等位酶分析方法广泛应用于研究天然居群的遗传结构、基因丰富程度以及栽培植物种质资源遗传多样性及树木种源群体遗传变异模式等(车永和,2003;甘四明等,1998).     

多杀菌素对黄褐天幕毛虫解毒酶及保护酶的影响

为了研究多杀菌素对黄褐天幕毛虫的杀虫活性及作用机制,采用叶片药膜法测定多杀菌素对黄褐天幕毛虫幼虫的毒杀效力,并用分光光度法检测LC50剂量药剂处理后不同时间点幼虫体内各种解毒酶和保护酶活性的变化.结果表明:多杀菌素对4龄、5龄幼虫均表现出极高的杀虫活性,见效速度块;而且黄褐天幕毛虫4龄、5龄幼虫经过多杀菌素处理后,谷胱甘肽S-转移酶均表现为复杂的抑制-激活-再抑制作用,多功能氧化酶活性则均表现为先抑制后激活的作用.多杀菌素对4龄幼虫羧酸酯酶活性具有激活作用,对乙酰胆碱酯酶和过氧化物酶均具有先激活后抑制作用,对超氧化物歧化酶具有先激活再抑制后激活的作用,对过氧化氢酶则表现为复杂的先抑制再激活后抑制作用.对5龄幼虫羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶及过氧化物酶活性具有明显的抑制作用,而对过氧化氢酶则表现为先抑制再激活后抑制的作用.因此,多杀菌素能有效干扰昆虫解毒和保护系统,扰乱其正常的生理代谢,从而起到较好的毒杀效果.     

酶酶活力表征方法的改进

Cx酶酶活力的传统测定方法由于底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）浓度低、粘度大且是变量等原因造成了较大的系统误差。本研究是在不同底物浓度下测定了康宁木霉AS3．4262表达的Cx酶酶活力，并对结果进行了多项式回归，测算出不同底物浓度下反应的初速度，求得米氏常数（Km）和最大反应速率（vmax）值。研究发现传统测定方法使用的底物浓度与Km在一个数量级上，难以合理测定酶活性，而底物物性限制了底物浓度提高。作者采用多项式回归测定vmax来表征酶活力，优点是结果不受检测过程中底物浓度变化的影响。     

思茅松等位酶实验方法及改进

以思茅松种子的胚乳为实验材料，探索了思茅松等位酶的实验方法。采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳与水平切片淀粉凝胶电泳相结合的方法，获得所试验的13种等位酶中AAT，ADH，EST，GDH，G6PD，MDH，PGD-6，PGM和SKD等9种电泳效果良好的等位酶酶谱。通过两种电泳方法的有机结合，以及对制样及上样方法的改进，大大地提高了实验效率。本研究得到的等位酶酶谱式样，为下一步思茅松种群遗传分析提供了资料。     

水分逆境对沙棘叶片脯氨酸,过氧化物酶,过氧化氢酶等的影响

通过对2年生中国沙棘(Hippophae rhamnoides L.Subsp.sinensis)在水分逆境(淹水、干旱)下脯氨酸、过氧化物酶、过氧化氢酶含量(活性)变化动态及细胞差别透性、丙二醛、可溶性总糖含量进行了研究。结果表明,在水分逆境下,沙棘叶片中的脯氨酸、过氧化物酶、丙二醛、可溶性总糖含量(活性)及细胞差别透性均有不同程度的提高,而过氧化氢酶活性下降。淹水处理植株的受害程度重于干旱处理植株。沙棘表现出了良好的抗旱、耐涝特性.     

漆树酶的固定化——Ⅱ对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂固定化漆树酶的研究

漆树酶(EC.1.10.3.2)共价偶联在对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂上。研究了固定漆树酶的条件,比较了琼脂与琼脂糖两种固定化酶载体。固定化漆树酶的活力达23光密度变化值/分·克(干),活力回收达37％。找出了固定化漆树酶的最适温度和最适pH,测定了它的米氏常数,热稳定性和重复使用性,并且与天然漆树酶进行了比较。探讨了残余重氮盐对固定化酶的影响。固定化漆树酶能重复使用二十次以上,其热稳定性也优于天然漆树酶。     

木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶高产菌株的诱变育种

利用低能N+注入,对产木质素过氧化物酶(Mnp)和锰过氧化物酶(Lip)活力均较高的菌株N1023进行诱变,研究了不同能量和不同剂量N+离子诱变后菌株的存活率与突变率、突变菌株的产酶活力及遗传稳定性.结果表明:不同能量和不同N+离子剂量注入对菌株有显著影响,诱变菌株N1023j产Mnp和Lip双酶活力分别提高了27.29%和22.58%,同时诱变菌株N1023j有很好的遗传稳定性.