转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%~19.8%,叶绿素含量提高了11.3%~106.9%,SOD活性上升45.8%~93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%~58.1%,MDA含量下降了25.7%~50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。     

农杆菌介导的转双价基因耐草甘膦玉米研究

本研究构建了含有耐草甘膦基因G2-epsps和R79-epsps的双价植物表达载体pCMG2R79-EPSPS,以优良玉米自交系78599和综31的幼胚为受体材料,采用农杆菌介导法将耐草甘膦双价基因G2R79-epsps转入玉米幼胚细胞,以期获得耐草甘膦性更高的转基因玉米植株。目前已获得转基因再生玉米植株32株,经特异PCR检测表明其中7株植株转入了目标基因,阳性率达到21.9%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,经田间喷施除草剂试验结果表明,获得了可耐草甘膦6‰的玉米材料,即生产上草甘膦田间使用浓度3倍水平的材料,为抗除草剂玉米新品种选育提供了较好的基础材料。     

转双价抗虫基因Bt-pta玉米植株的获得

以7922、8902、4112、340和853为受体材料,研究不同基因型的愈伤组织诱导与再生芽苗的关系,其中7922芽苗率为76.4%;8902、4112、340芽苗率分别为8.2%、12.7%和0%和11.8%,结果显示7922主要以体胚发生为主,芽苗率高,是遗传转化的良好受体材料。且胚性愈伤组织随着继代次数的增加变异率随之增加,应尽量减少继代次数以提高转化率。研究进一步利用PDS-100型基因枪将包含抗除草剂基因（bar）、苏云金杆菌毒蛋白基因（cryIA(a)）和半夏凝集素基因（Pinellia ternata agglutinin, PTA ）的聚合载体p3300-bt-pta导入7922的胚性愈伤组织,经PPT（3mg/L）筛选,获得抗性愈伤组织和再生植株。从获得的28株再生植株中筛选获得22株具有除草剂抗性的植株,PCR分析表明有7株同时含有Bt、PTA、Bar 三个基因,共整合的频率为31.8%,结果表明将多价抗性基因同时导入玉米获得多抗的转基因玉米材料是可行的,这为通过转基因聚合育种培育创造同时抗鳞翅目害虫和同翅目害虫的玉米品种奠定了基础。     

转sbk和sck抗虫基因水稻的获得

转入多个抗虫基因是解决水稻抗虫的一条有效途径.本研究采用根癌农杆菌介导法将2个抗虫基因(sbk和sck)同时转入3个水稻品种中,通过一系列的分子检测(PCR和RT-PCR)分析,这2个基因已经成功转入3个水稻品种中并得到了表达;同时还获得1株不含抗生素筛选标记基因(hpt)和抗虫sbk基因,却含抗虫sck基因的转基因植株,命名为YJ27-5sck.用该植株作为供体,通过杂交将sck抗虫基因转育到另外5个水稻品种中且同样得到了表达,获得了不含筛选标记基因的转sck基因阳性植株.     

转Cry1Ab-t基因玉米YA108的获得及其抗虫性鉴定

为了培育优良的抗虫玉米自交系,通过农杆菌介导的方法,将含有自主改造合成的抗虫基因Cry1Ab-t的植物表达载体pCAMBIA3300m导入玉米杂交种HiII基因组中,通过双丙氨磷筛选、PCR检测获得阳性转基因植株,采用RT-PCR、试纸条、ELISA方法检测外源基因的表达情况,并进行抗虫性鉴定.结果表明,用双丙氨磷筛选...     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

根癌农杆菌介导的转双价抗虫基因(CryIA+CpTI)苎麻

利用苎麻下胚轴高频再生体系,将携带人工合成的CryIA杀虫基因和CpTI基因的高效双价杀虫基因的植物表达载体pGBI4ABC转化到苎麻主栽品种中苎1号中。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用50 mg L^–1卡那霉素+ 300 mg L^–1头孢霉素筛选共获得32株抗性植株; PCR检测显示26株为阳性, 占80%。Southern杂交结果证实, 外源基因已经整合到苎麻的基因组中。这项研究为最终创造兼抗鳞翅目及鞘翅目等害虫的苎麻种质材料奠定了基础。     

棉花抗虫基因工程研究进展

抗虫转基因棉花的培育是近年来棉花生物技术研究的热点，它为棉花虫害的防治展示了希望。用于棉花抗虫基因转化的方法有根癌农杆菌Ti质粒介导法、聚乙二醇法、基因枪法和花粉管通道法。用于棉花抗虫植株培育的主要基因有BT基因和CPTI基因，其中BT基因应用较多，用其培育出的转基因棉花，在田间用药量减少50％的情况下而不影响产量，这些转基因棉花在美国已大面积示范推广。     

根癌农杆菌介导转Bt基因苎麻的获得及其抗虫鉴定

采用本研究室建立的根癌农杆菌介导的高效遗传转化体系,转化苎麻优良品种芦竹青,获得了转Bt基因苎麻候选植株。通过PCR和Southern杂交等分子检测,证明Bt基因已经整合到部分候选植株基因组中。选取PCR和Southern杂交均为阳性的部分株系(T₀)种植在大田,对这些植株进行室内抗虫鉴定并考察其主要农艺性状和品质性状,次年对T₁代植株进行PCR和Southern杂交检测。结果表明, 与对照相比,T₀代转Bt基因苎麻植株的抗虫性均强于对照,部分株系的抗虫性显著强于对照植株;且基本保持了亲本的优良性状;T₁代植株中也含有Bt基因,表明Bt基因能稳定遗传,且T₁代植株在大田的抗虫性明显强于非转基因植株。     

抗玉米丝黑穗病转基因株系的分子检测及抗病株系选育

采用花粉介导方法将质粒pGL II_RC_1导入玉米自交系海92_1中,获得了T0种子128粒,种子经潮霉素抗性筛选得到抗潮霉素植株16株。对抗性植株分离的统计分析表明,多数情况下几丁质酶基因以单拷贝形式导入转基因植株,后代分离比约为3∶1。抗性苗移栽到大田后,5~6叶期取样进行PCR扩增、PCR Southern blot杂交分析,对T1的分析结果表明,几丁质酶基因已导入转基因植物细胞中。对T2,T3植株的检测结果显示,目的基因已整合到转化植株基因组中并可随植株世代稳定遗传。田间抗病鉴定结果表明,转基因植株及后代的玉米丝黑穗病发病率明显比对照降低。根据分子检测及田间抗病鉴定结果,得到GH05024,GH05028 2个抗丝黑穗病的纯合转基因株系。     

转双价基因抗虫杨抑制美国白蛾的作用机理研究

为明确双价基因chitinase-BmkIT对鳞翅目害虫的作用机制,以美国白蛾为供试虫源,用转双价基因(烟草天蛾几丁质酶基因和东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素基因)杨树叶片饲喂其幼虫,至3龄时,采用石蜡切片法,对美国白蛾幼虫中肠结构进行观察,并对其头部乙酰胆碱酯酶活性进行测定.结果表明,取食转基因杨树叶片的美国白蛾幼虫中肠结构不完整,中肠细胞出现排列不整齐、脱落等现象;而取食非转化杨树叶片的美国白蛾幼虫中肠结构完整,中肠细胞排列整齐紧密.转基因杨树叶片还显著抑制了美国白蛾幼虫头部乙酰胆碱酯酶的活性(p＜0.05).取食转chitinase-BmkIT基因杨树叶片抑制了幼虫的生长,并使部分幼虫身体溃烂.该双价基因可作为防治美国白蛾的基因源.     

转AhCMO基因玉米后代的获得及耐盐性鉴定

试验采用超声波辅助花粉介导法将山菠菜胆碱单加氧酶(AhCMO)基因转入玉米自交系‘郑58’中,经抗生素筛选、PCR检测及自花授粉获得转CMO基因的T2代玉米种子。选取5份T2代玉米种子盆栽进行耐盐性鉴定试验。首先针对其非转基因受体材料筛选出耐盐性鉴定浓度,其后通过生理生化指标对转基因T3代株系进行耐盐性鉴定,同时筛选耐盐性强的株系。结果表明:耐盐性筛选及鉴定的适宜浓度为250mmol/L;依据对苗期生理生化指标的测定分析,在250mmol/LNaCl胁迫下,转基因玉米植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及叶绿素含量高于非转基因玉米,丙二醛(MDA)含量低于非转基因玉米。SOD活性提高了2%~208%;POD活性提高了22%~65%;叶绿素含量增加了8%~61%;MDA含量减少了3%~93%。试验表明,耐盐基因CMO的转化提高了玉米的耐盐性。依据生理生化指标变化情况建立的耐盐性级别评价方法显示,5份参试株系中耐盐性比对照提高3级的有2份。     

猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35 S启动子--猪α乳清蛋白基因--终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化.利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株.对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中.     

禾谷镰刀菌引起玉米青枯病的抗性基因遗传分析

对两亲本、杂种F1与F2群体进行单一致病菌(禾谷镰刀菌)的单株接种鉴定,统计了抗病、感病植株的分离情况,并在分子水平上对F2群体做了初步分析.结果表明:用单一致病菌(禾谷镰刀菌)接种也能引起玉米青枯病,其抗性基因是显性单基因.进而推测抗不同致病菌引起的玉米青枯病的抗性基因可能在染色体的不同位点上.     

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法, 将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入玉米自交系郑58, 获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot杂交分析, 证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T₂代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理, 结果表明, 转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性, 生长状况明显优于对照; 根据非转化苗对NaCl的反应以及生长状况, 确定250 mmol L^-1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度; 依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果, 与对照相比, 转基因植株的株高提高10.94%~25.7%, 鲜重增加8.62%~18.2%, 干重增加9%~18.18%, 相对电导率降低37.21%~58.14%, 叶绿素含量增加15.89%~90.65%, 超氧化物歧化酶(SOD)活性提高64.92%~148.29%, 丙二醛(MDA)含量减少26.97%~48.05%。综上所述, 转入甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。     

利用可视化标记建立Cre-loxP介导的抗生素删除载体系统并应用于玉米转基因研究

本研究通过Cre-loxP系统,构建了Kan基因的删除载体系统,利用花青素合成途径中转录因子的表达指示删除的效果。首先,利用两次PCR方法对pGreen载体进行改造,在卡那霉素抗性(Kan)基因的两侧加入两个同向的loxP位点,在多克隆位点前插入5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的表达框作为筛选标记基因,命名为pBAC823。在此载体基础上,构建了两个植物表达载体,组成一个抗生素可删除的载体系统。其一是在pBAC823载体Kan基因的一侧加入花青素合成途径中两个转录因子bi基因和cl基因的表达框,命名为pBAC9008。该载体可以作为基础植物表达载体,用于表达目的基因。其二是含Cre酶基因表达框的植物表达载体。将hsp70启动子驱动的cre基因的表达框插入pBAC823载体Kan基因的一侧,并将玉米花青素基因合成途径中转录因子bi和cl的表达框插入多克隆位点,命名为pBAC9009,此载体作为一个删除载体,单独转化植物,之后可以通过杂交方法删除目的基因表达载体中两个loxP位点之间的Kan基因片段。将上述载体转化玉米幼胚,得到T0代转基因玉米的种子,其中部分籽粒为紫色,分子检测结果表明紫色籽粒有花青素基因的插入,验证了花青素合成基因作为可视化标记的可靠性。本研究采用了可视化标记跟踪外源基因的表达和抗生素抗性基因的删除,不仅大大降低了外源基因的检测成本,为转基因食品安全提供技术保证,在转基因研究中具有重要的意义。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。