棉花生长素结合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及序列分析

生长素结合蛋白(ABP1)在植物细胞发育中起着重要作用.在ABP1蛋白的保守区设计引物,利用RT-PCR和RACE方法,首次克隆了棉花ABP1基因cDNA的3'和5'末端.测序及生物信息学分析表明,该基因cDNA全长824 bp编码190个氨基酸,它所编码的氨基酸序列包含植物ABP1蛋白家族的所有特征,被命名为GhABP1.棉花ABP1所包含的Box A,Box B和Box C区在植物ABP1家族中是高度保守的.它的C末端氨基酸残基WDE在蛋白质的折叠及ABP1在质膜上的功能活性方面都具有重要的作用.棉花ABP1的C末端带有KDEL残基区,这个KDEL区表明它被定位在内质网上.用Clustal W软件进行多重比对分析表明,棉花ABP1与拟南芥、向日葵、油菜、辣椒、甘菊的氨基酸序列同源性分别为72%,72%,71%,70%和70%.系统进化分析表明,棉花在进化上与萝卜、拟南芥和油菜聚为一类.序列分析表明此基因为生长素结合蛋白基因家族的新成员.     

玉米BADH基因的克隆与序列分析

Betaine was accumulated as a nontoxic and protective osmolyte in water-dificit and salt-stressed plants. Betaine aldehyde dehydrogenase for glycine betaine synthesis is an important enzyme. The BADH gene of Maize was cloned by RT-PCR and RACE. The gene is 1 762 bp in length, including an open reading frame of 1 515 bp.Its nucleotide sequence shares 95% with the the partial cDNA of BADHI from Sorghum bicolor. Its deduced amino acid sequence contains the conserved domain sequence “VTLELGGKSP“ of ALDH, and a tripeptide SKL at its C-terminal, a signal targetting to the microbodies. The phylogenetic tree of 20 BADHs was constructed,which corresponds to the classical botanical division of plant, the BADH of maize is closest to the one of Oryza Sativa.     

芥菜型油菜PAP1基因的克隆与表达分析

花青素是导致芥菜型油菜叶片颜色差异的重要物质,PAP1基因是花青素合成途径中的一个关键转录调控基因.本研究利用同源克隆技术,以不同叶色芥菜型油菜为材料,根据同源性较高的白菜PAP1基因序列设计引物,克隆芥菜型油菜PAP1基因序列.芥菜型油菜PAP1基因的基因长度在1348～1669 bp,编码序列长744～753 bp...     

海岛棉DAHP基因的克隆及分子特性分析

棉花黄萎病严重影响中国的棉花产量和品质。本研究以海岛棉cDNA为模板扩增得到3个DAHP基因片段,分别命名为GbDAHP-1、GbDAHP-6、GbDAHP-7。序列分析显示,GbDAHP-1基因全长为1 755 bp,编码539个氨基酸,理论分子量为59.4 kD,等电点为8.70;GbDAHP-6基因全长为1 644 bp,编码519个氨基酸,理论分子量为57.176 11 kD,等电点为8.94;GbDAHP-7基因全长为1 554 bp,编码517个氨基酸,理论分子量约为57.177 14 kD,等电点为8.12。通过在线软件分析得知3个蛋白质的理化性质相似,均为亲水性蛋白,不含跨膜运输结构域,位于叶绿体。系统发育树显示：GbDAHP-1、GbDAHP-6和GbDAHP-7基因与陆地棉、雷蒙德氏棉、可可的序列相似度较高,与陆地棉以及雷蒙德氏棉的蛋白质相似度最高,亲缘关系最近。在黄萎病菌诱导下GbDAHP基因显示先上升后下降的趋势,表明该基因受到黄萎病菌诱导表达。     

高糖甜菜BvNHX1基因的克隆及表达特性分析

本研究以高糖甜菜品种‘BS02’为材料,采用同源克隆技术分离其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为BvNHX1。该基因包含有1 659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸,蛋白分子量为61.31 kD,理论等电点为6.31。预测该基因编码的蛋白具有12个跨膜结构域,同时具有Nhap、Na_H_Exchanger和b_cpa1超家族的保守结构域,而且与盐角草、犁苞滨藜、盐地碱蓬等多种藜科植物NHXs聚为一类,属于液泡膜NHX家族中的ClassⅠ成员。实时荧光定量PCR结果显示:在400 mmol/L NaCl、200 mmol/L KCl和15 mmol/L ABA处理下,该基因表达量分别在叶和根中达到峰值,且叶中的表达量均显著高于根中,表明该基因在响应NaCl、KCl和ABA时,可能在叶中发挥的作用远大于根中。本研究结果将为甜菜耐盐分子机理的研究奠定基础,同时为高糖甜菜耐盐性遗传改良提供坚实可靠的依据。     

玉米丝氨酸羧肽酶基因(ZmSCP)的克隆及表达分析

丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidases, SCP)基因在植物生长发育及抗病性方面起着重要作用。本研究在立枯丝核菌胁迫24 h后, 以RT-PCR技术和RACE技术克隆玉米丝氨酸羧肽酶基因全长cDNA序列, 命名为ZmSCP。结果显示, 该基因全长为1874 bp (GenBank登录号为JF682634), 开放阅读框为999 bp, 编码332个氨基酸, 相对分子量为36.505 kD, 等电点为4.75。ZmSCP基因编码蛋白与其他高等植物中该蛋白具有一定的同源性, 同源性比例范围为42%~81%。进化树分析表明ZmSCP基因与水稻、高粱亲缘关系较近, 属于同一进化分支。ZmSCP基因编码蛋白序列保守结构域分析显示该基因编码产物具有S10结构域, 属于S10超家族。半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR结果表明, ZmSCP基因在立枯丝核菌、ABA、JA、低温、高盐胁迫条件下, 总体均呈诱导表达的趋势。其中, 在立枯丝核菌AG1-IA诱导下, ZmSCP基因表达呈两步诱导趋势, 第1次诱导出现在接菌后24 h, 然后下降, 第2次诱导出现在接菌后60 h。在ABA、JA、低温和盐胁迫下, ZmSCP基因表达均呈现上调趋势, 表达高峰均出现在胁迫后48 h。     

小麦水通道蛋白TaTIP1-4DL基因的克隆及表达分析

TIPs家族是一类位于液泡膜上的膜内在蛋白,负责调节细胞膨压,可以响应植物逆境胁迫。为进一步探究小麦中TIPs基因的表达模式和生物学功能,利用同源克隆的方法从小麦旗叶中扩增出TaTIP1-4DL基因,其编码区序列全长771 bp,编码257个氨基酸。生物信息学分析显示:该蛋白分子质量为26.3 ku,理论等电点为6.82,为疏水稳定性蛋白;三级结构为保守的沙漏结构,包含6个长α螺旋和2个短α螺旋,符合水通道蛋白的经典模型;氨基酸比对和进化树分析表明,小麦中的TaTIP1-4DL蛋白与山羊草、二穗短柄草中的同源关系较近,并包含6个跨膜区和2个保守的NPA基序;启动子顺式作用元件中包含与逆境相关的响应元件。组织特异性表达分析显示,TaTIP1-4DL基因在小麦不同组织器官中均有表达,且叶片中的表达量最高,茎中最少。胁迫表达分析表明,干旱、脱落酸、高盐对叶片和籽粒中TaTIP1-4DL基因的表达有不同程度的诱导,表达水平普遍呈现先上调后下降的趋势,其中干旱对叶片中该基因的诱导水平最高,干旱处理6 h后,叶片中的表达量达到胁迫前的14倍。     

荠菜生长素极性运输基因1(CbPIN1)的克隆与表达分析

为了探讨荠菜PIN1基因的生物学功能,根据Gen Bank中拟南芥PIN1氨基酸序列,设计同源引物,通过RT-PCR技术,克隆了荠菜PIN1基因(CbPIN1)编码区c DNA序列;生物信息学方法分析了荠菜PIN1蛋白结构特征,并进行了亚细胞定位与原核表达;荧光定量PCR方法检测了PIN1组织表达特性;构建了植物表达载体p BI121-CbPIN1,并获得转基因植株。结果表明,CbPIN1 c DNA序列全长1 869 bp,C+G含量为49%。Blast比对结果显示,CbPIN1与拟南芥PIN1基因高度同源,相似性高达93%。进一步分析发现,CbPIN1可编码1条622个氨基酸的多肽,CbPIN1蛋白分子质量为67. 05 ku,等电点为9. 02,碱性氨基酸(K、R)个数为49,酸性氨基酸(D、E)个数为42,疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)个数为241,极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)个数为157。CbPIN1属于跨膜蛋白,含12个丝氨酸磷酸化位点,1个苏氨酸磷酸化位点。亚细胞定位结果显示,CbPIN1定位于细胞膜; CbPIN1在荠菜不同组织均有表达,其中,根中表达最高,种子中表达最低。原核表达显示CbPIN1蛋白大小87. 05 ku。过表达荠菜植株中CbPIN1基因表达量均显著增加。试验结果为进一步分析CbPIN1在荠菜器官发育中的作用奠定了基础。     

野芥芥酸合成酶基因fae1的克隆与序列分析

根据GenBank中脂肪酸延长酶基因fae1序列(AY 888037)设计了PCR扩增引物,以野芥总DNA为模板进行扩增得到了特异扩增条带.测序结果表明,该片段长1 651 bp,序列分析表明其氨基酸编码区为55～1 575 bp,不含内含子序列,共编码506个氨基酸.该基因序列已提交GenBank,登录号为FJ870905.BLASTn分析结果表明,野芥中fae1基因与其他芸薹属品系的fae1基因核苷酸同源性为76%～98%;BLASTp分析结果表明,野芥中的FAE1与油菜中FAE1存在32个位点差异,其中部分差异可能导致了芥酸含量的不同.     

Methods for Plant Differential Expressed Gene Cloning and Progress

The research of plant genome has been transferred from the structural genomics focusing on determining the complete sequences of the genome to the functional genomics focusing on elucidating the biological function of genes. Now cloning differential expressed genes is of prime interest in molecular biology. In the past ten years, some methods used for studying changes of gene expression in plants have been developed. The authors review the developments of techniques and studies for the plants related gene cloning in RNA level and expound their principles, technical routes, improved methods, advantages and defects. Moreover, their applications and prospects in plants related studies are discussed.     

玉米ZmNAOD基因的克隆与功能分析

玉米籽粒发育和光周期特性是影响产量的关键因素。本文通过RT-PCR方法, 从玉米骨干自交系昌7-2籽粒的cDNA中克隆得到一个乙酰鸟氨酸脱酰酶基因, 命名为ZmNAOD。ZmNAOD的CDS (coding DNA sequence)长1344 bp, 编码447个氨基酸。qRT-PCR分析表明, ZmNAOD基因在玉米雄穗中的表达量最高, 其次是在籽粒、叶、茎、根中; 该基因在授粉后不同天数籽粒中的表达趋势为, 0~15 d快速上升, 之后迅速下降。对该基因的过表达转基因拟南芥的研究表明, ZmNAOD基因在转基因拟南芥的根中表达量最高; 经暗处理10 d后, 转基因株系根的长度显著长于野生型; 转基因拟南芥的生育期明显提前, 其粒长和千粒重显著大于野生型拟南芥。这些结果表明, ZmNAOD基因的表达可能与籽粒发育和光周期调控有关。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

蚜虫诱导的小麦基因cDNA的克隆及其表达特性分析

蚜虫是小麦的重要害虫之一,而且能传播多种病毒病(包括大麦黄矮病毒),最终导致小麦严重减产.防治虫害对小麦稳产具有重要意义.依靠化学杀虫剂防治虫害,不但费用较高而且易使害虫产生抗药性,同时还会造成农药残留和环境污染,危害人类健康.传统小麦抗虫育种周期长、见效慢.转基因技术为培育抗虫小麦提供了一条快捷、高效的方法.然而在长期选择压下,害虫对转基因作物产生抗性已成为制约抗虫作物推广应用的现实因素[1].如何防止或延缓害虫产生抗性,已经成为植物抗虫基因工程的另一重要研究内容.在目前的抗虫转基因植物中,使用最多的是组成型表达的启动子,它使抗虫基因在植物生长发育的全周期以及各种组织中都表达.这种长期的选择压,无疑会大大提高害虫对转基因植物产生抗性的几率.为了解决这一问题,人们已经开始重视使用组织特异性启动子[2]和诱导型启动子[3],使抗虫基因只在特定部位、特定时间或者只在植物受到害虫侵害时进行表达.这样就减少了害虫处于选择压下的时间,从而可以延迟或阻止害虫产生抗性.     

基因克隆策略在抗稻瘟病基因分离中的应用

稻瘟病是限制水稻生产的主要病害之一,不断分离克隆抗性基因并通过现代生物技术培育抗病水稻新品种是防治该病最经济有效的途径。介绍了当前4种主要的基因克隆即转座子标签法、图位克隆法、电子克隆法和电子图位克隆法的原理和操作流程,并概述了已克隆的19个稻瘟病抗性基因的克隆途径,分别举例介绍了抗稻瘟病基因图位克隆策略、电子图位克隆策略和转座子标签法克隆策略的主要流程。结合研究实践,提出稻瘟病基因的克隆要在不断通过对抗病基因结构和功能深入了解的基础上,灵活选择不同基因分离策略,发挥多种克隆策略的长处。     

欧李ChIRT1基因的克隆与生物信息学分析

欧李(Cerasus humilis)是蔷薇科矮生灌木,果实中的钙、铁等营养物质丰富.铁调转运基因1(IRT1)编码的蛋白是ZIP金属转运家族中主要的铁转运蛋白,负责植物中金属离子的转运,尤其是铁的吸收.本研究从欧李叶片中提取RNA,逆转录得到cDNA;参照小金海棠(Malus xiaojinensis)MxIRT1基...     

杨梅肌动蛋白基因MrActin1的克隆及表达分析

扩增杨梅嫩叶中肌动蛋白基因(MrActin1)全长编码区cDNA序列,并评价MrActin1的进化地位,同时分析MrActin1的表达模式。利用RT-PCR扩增MrActin1全长编码区cDNA序列。用生物信息学手段分析预测MrActin1的理化性质和同源性,用临接法构建其的系统发生树。通过Northern blot分析MrActin1在不同组织部位的表达。该基因cDNA序列（GenBank登录号AB 650589）全长1137 bp,编码了1个由377个氨基酸残基组成的蛋白质,所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin氨基酸序列的相似性均在88%以上,根据高等植物Actin相似性构建了进化树,表明MrActin1与陆地棉、圆叶锦葵Actin之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。Northern blot分析表明,MrActin1在杨梅的花、叶、枝条和果组织中恒定表达。首次获得了杨梅MrActin1 cDNA全长序列。     

陆地棉开花相关基因GhFLP1的克隆与功能验证

为了明确陆地棉开花促进因子基因的作用,以中棉所36叶片基因组DNA和cDNA为材料克隆得到了开花相关基因Gh FLP1,分析了其特征及功能。该基因全长为537 bp,包含339 bp开放阅读框,编码112个氨基酸。预测分子量约为12.176 kDa,理论等电点为9.13。组织特异性表达分析表明,该基因在花蕾中优势表达,且在早熟品种(中棉所36、中棉所74)中表达量高于中熟品种(中棉所60、鲁棉研28)。启动子序列分析和外源激素处理实验表明该基因受水杨酸和赤霉素调控。农杆菌介导转化拟南芥发现,该基因能促使拟南芥莲座叶减少,开花期提前。荧光定量结果表明,在转基因拟南芥中,内源开花相关基因AtFT、AtLFY、AtAP1和AtSOC1表达量不同程度上调,AtFUL表达量基本不变,AtFLC表达量下调。研究结果显示该基因可能参与陆地棉开花时间的调控,为创制转基因早熟棉花新材料打下基础。     

图位克隆技术在玉米基因分离中的应用

图位克隆技术属于正向遗传学的范畴,它以突变表型在遗传群体中的分离为出发点,致力寻找导致突变的遗传基础,最终克隆出目的基因。本文简要介绍了图位克隆技术的遗传定位原理以及在玉米基因分离中的关键技术环节,包括遗传群体的构建,多态性分子标记的筛选,目的基因的初定位,精细定位,候选基因的获得、基因的功能验证等,最后分析了图位克隆技术在玉米中应用可能遇到的问题以及可采取的解决措施。     

棉花基因克隆研究进展

棉花的基因克隆主要集中在纤维品质、抗逆、棉酚相关基因、叶绿体基因、调控元件和发育相关酶蛋白等六个方面。在纤维品质方面,我国已克隆了β-微管蛋白基因、E6基因、GhbZ-IP、GhIAA16和40个棉纤维特异表达基因,同时还得到一批性质不清楚的cDNA克隆。国外已分离出Fbl2A、Rac13、.Rac9、MYB基因和20余个纤维发育相关基因。在抗逆性方面已得到了LRR-RC基因、14-3-3蛋白和PR蛋白基因等以及一些cDNA克隆。