维氏气单胞菌AcrV基因的克隆与原核表达

【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度（0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2,3,4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

胞内分枝杆菌HBHA基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因,使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体,经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序,构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导,纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示,ORFV116基因全长561 bp,编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa,为不稳定亲水性蛋白;无信号肽、保守结构域及跨膜结构域;含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲为主,分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）;预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示,ORFV116蛋白大小约为51 kDa,主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物,将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端,同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术,从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接,利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选,然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆,成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas,然后将质粒转化至E.coli BL21感受态,设置不同IPTG浓度和诱导温度,选择最佳的表达条件,然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明,在pET28a表达载体中,Fas基因的插入方向和读码框均正确;同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的,融合蛋白分子质量为39.7 ku。     

新疆野生核桃 JfDREB1A基因的克隆与原核表达分析

为探究 DREB1A基因在新疆野生核桃响应低温胁迫中的作用及表达特性,以新疆野生核桃群体中的‘小矩圆’类型为试验材料,根据同源克隆的方法得到 JfDREB1A基因的cDNA全长序列,利用荧光定量PCR检测其在低温胁迫条件下的表达水平;将该基因片段重组到pET-28a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌（DE3）感受态细胞中诱导表达。结果表明,获得了新疆野生核桃中的DREB1A,将其命名为 JfDREB1A,该基因的开放读码框长度为645 bp,具有典型的 DREB1/CBF转录因子结构特征,JfDREB1A蛋白与其他植物DREB1蛋白具有高度保守性,与核桃亲缘关系最近。RT-PCR分析显示在4 ℃低温胁迫下, JfDREB1A基因的表达量迅速上调,8 h时达到最大。成功构建了pET-28a-JfDREB1A重组表达质粒,得到大小约为29 ku的融合蛋白,与预测蛋白大小相符,该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导2 h。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

蓝舌病病毒 NS4 基因原核表达载体的构建与表达

蓝舌病病毒（Bluetounge virus,BTV）非结构蛋白4（Non-structural protein 4,NS4）拮抗干扰素的产生,在BTV逃避宿主天然免疫的过程中发挥重要作用。利用PCR扩增得到 NS4 基因,与空载体pET-32a双酶切后连接,构建pET-32a- NS4原核表达载体;将pET-32a- NS4转化至E.coli BL21感受态细胞,以IPTG诱导表达;利用SDS-PAGE确定IPTG的最佳诱导浓度、时间与重组蛋白的表达形式;利用Western blot分析重组蛋白的表达情况。结果表明,成功构建pET-32a- NS4原核表达载体;IPTG最佳诱导浓度为 0.8 mmol/L,时间为6 h,蛋白主要以包涵体形式表达;Western blot在27 ku处可见目的条带,与预期相符。本研究成功构建pET-32a- NS4原核表达载体,实现NS4蛋白的大量、高效表达,为进一步探究NS4蛋白在BTV拮抗宿主天然免疫中的作用机制提供材料。     

鸡白痢沙门氏菌的分离与鉴定

[目的]探索20日龄雏鸡出现有关节肿胀、拉白色稀粪和少量死亡等症状的疾病病因,为鸡场的疾病诊断和防治提供建议和有效措施。[方法]采集病鸡样品并进行了细菌学检验。通过细菌分离、PCR、生化试验和回鸡试验鉴定出5株鸡白痢沙门氏菌。[结果]用分离株感染SPF雏鸡,能复制出与自然感染一致的病例。[结论]鸡白痢沙门氏菌是造成鸡场该次疾病的主要病原。     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

卵形鲳鲹 SST1基因的克隆与组织表达

为了解卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus） SST1基因的生物学信息、胚胎发育不同时期的表达水平及其在组织中的表达和分布情况,进而探讨 SST1基因可能的生理功能及作用机制。对卵形鲳鯵基因组（登录号: PRJNA574895）中的 SST1基因（ID:EVM0001630）进行生物信息学分析,并对其在卵形鲳鯵胚胎发育的不同时期及其在幼鱼不同组织中的表达情况进行定量分析。结果表明,卵形鲳鲹的 SST1基因全长1 155 bp,开放阅读框序列长1 104 bp,共编码368个氨基酸,蛋白分子质量为41.42 ku,理论等电点pI为8.47,属于带正电的疏水性蛋白。SST1蛋白无信号肽序列,亚细胞定位主要于细胞质膜,属于膜蛋白,包含17个磷酸化位点,存在7个跨膜结构域,三维结构主体为7段α-螺旋并列扭曲排列成的一柱状结构。序列比对和系统进化树分析显示,卵形鲳鲹与黄尾鰤和高体鰤共聚于一个分支,氨基酸序列同一性分别为98.39%和  98.37%。定量PCR分析结果表明, SST1在卵形鲳鲹胚胎发育的前13个时期微量表达,进入初孵仔期表达量迅速升高。 SST1在卵形鲳鲹幼鱼不同组织中的表达量差异极显著,其中在脑组织中表达量最高,其次是卵巢和精巢,在背鳍、皮肤、肌肉等其他11个组织中的表达量相对较低。说明 SST1在卵形鲳鲹神经内分泌、性腺发育及生殖细胞发生过程中可能发挥着重要作用。     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。     

鸡伤寒白痢沙门氏菌灭活菌苗的研制

由鸡沙门氏菌株C79-13和C79-20及新疆分离株AS97-19和AS96-4四株菌,经自制的改良硫代硫酸钠培养基,通气搅拌培养,甲醛灭活制成氢氧化铝佐剂苗,经免疫接种健康鸡,免疫后21d抗体水平达到最高,经ANAE方法和T淋巴细胞E花环方法检测,免疫组的细胞免疫水平明显高于非免疫对照组,差异极显著,10LD剂量强毒株攻菌试验,死亡保护率达94.7%,免疫组分离菌率为3.1%。表明该苗具有良好的安全性和免疫效果。     

小麦TaSPL17基因的克隆、组织特异性表达及原核表达分析

具有SBP结构域的SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用。为了进一步研究小麦基因TaSPL17的功能,本研究通过同源克隆的方法,从普通小麦品种‘小偃22’中克隆得到TaSPL17基因全长CDS序列。生物信息学分析表明,该基因开放阅读框长度1 158bp,编码385个氨基酸,理论分子质量40.25ku,理论等电点为9.12。半定量RT-PCR结果显示,TaSPL17在小麦根、茎基部、叶片、幼穗中均有表达,在幼穗和茎基部中表达量最高,根次之,在叶片中表达量最少,表明TaSPL17基因可能与小麦的分蘖和穗部的发育有关。将基因TaSPL17与载体pGEX6P-1连接构建原核重组表达载体pGEX6P-1-TaSPL17,然后将其转入大肠杆菌DH5α并对诱导表达的时间、IPTG浓度、温度进行优化,SDS-PAGE分析表明,融合GST标签的TaSPL17在温度37℃,IPTG浓度为0.4mmol/L,诱导3h后表达量最大,有助于进一步纯化TaSPL17蛋白质。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。