水稻类病斑突变体spl31的遗传分析与基因定位

利用EMS诱变水稻籼型恢复系缙恢10号, 从其后代中鉴定出一个类病斑突变体spl31, 该突变体三叶期以前表型正常, 四叶期后叶片陆续出现黄色斑点, 随着植株的生长, 面积逐渐扩大成边缘黄褐色的病斑, 至成熟时病斑相互连接成片, 导致叶片坏死。透射电镜结果显示突变体细胞的叶绿体基粒片层堆叠不规则。组织化学分析显示突变体细胞被染成深蓝色, 呈离散状分布, 说明spl31病斑是自发形成的。光合数据显示spl31基因突变对病斑叶片正常部位细胞的光系统II影响较小。农艺性状分析发现突变体千粒重下降、结实率降低。遗传分析表明, spl31的突变性状由1对隐性核基因控制, 该基因被定位于水稻第12染色体着丝粒附近, 引物ID104和ID11之间, 物理距离为383 kb, 并与标记ID105共分离。     

水稻类病斑突变体spl41的表型鉴定及生理分析

大多数水稻类病斑突变体会提高病程基因的表达从而抑制病原菌的生长,为进一步探索类病斑突变体抗病抗逆的机制,本研究对突变体spl41的形态性状、生理、抗病性等方面进行了研究。spl41是通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种‘黄华占’,获得的一个稳定遗传的水稻类病斑突变体。结果表明,该突变体从三叶期开始出现红褐色坏死斑,斑点数目随植株生长增多并导致枯黄衰老;突变体spl41类病斑的产生使株高、穗长、分蘖数、千粒重及结实率显著下降,并导致叶片的光合色素含量低于野生型;台盼蓝、NBT和DAB染色结果显示突变体spl41病斑部位有大量的死亡细胞并伴随着H_2O_2及O_2^-的积累,表明spl41植株病斑部位正在发生细胞程序性死亡。抗病性鉴定表明,突变体spl41相比于野生型对7个水稻白叶枯病菌生理小种的抗性增强;qRT-PCR分析表明PR1b、PR3、PR4、PR5、PBZ1和Cht1病程相关基因在突变体spl41中表达量上调。这些结果为探索植物抗病机制及选育植物抗病新材料提供了分子依据。     

水稻斑点叶突变体spl21的鉴定与基因定位

通过双环氧丁烷(diepoxybutane)诱变籼稻品种IR64获得一个稳定遗传的红褐色斑点叶突变体spl21(spotted-leaf 21)。大田条件下,突变体播种后约2周叶片上开始出现红褐色斑点,随后部分斑点融合,从叶尖开始发黄枯萎,并沿叶片两侧边缘向下扩散,严重时叶片大部分或整体枯死。突变体spl21与野生型IR64相比,其株高、穗长、有效穗数、实粒数、结实率和千粒重等农艺性状均显著降低。组织化学分析表明,叶片斑点处及周围有H2O2沉积。突变还导致叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量极显著降低,叶片光合能力明显下降;此外,突变体中CAT、SOD、APX和可溶性蛋白含量均极显著降低,POD活性则极显著升高。遗传分析表明,突变体表型受1对隐性核基因控制。通过图位克隆法最终将该基因定位于第12染色体长臂下端介于In Del-8和RM28746之间约87 kb的区段内,暂名spl21(t),本研究为该基因的克隆与功能研究奠定了基础。     

水稻假病斑基因spl1突变体基因的克隆

水稻假病斑基因spl1是由一对隐性基因控制。其表型是自发产生类似于病斑的假性病斑。spl1基因能增强水稻对稻瘟病的抗性。利用图位克隆法克隆该基因。我们建立了3202个后代分离群体(2950个spl1表型)。已找到10个和spl1基因紧密连锁的CAPS分子标记，分布在12号染色体约8．8cM的区域，通过筛选这些分离群体，     

一份新的水稻斑点叶突变体spl32的鉴定和基因定位

从F2(粤晶丝苗2号/H4)群体中,鉴定出一份显性斑点叶突变体spl32(spotted leaf 32)。其叶片褐色斑点受自然光诱导,在幼穗分化期从叶尖逐渐扩散至叶鞘,台盼蓝染色表明斑点并非由细胞死亡引起。以从F5杂合个体分离出的正常叶色植株为对照,斑点叶植株的穗粒数、结实率显著降低。斑点出现后,spl32的POD活性和MDA含量均显著高于对照;同时,spl32叶片光合色素含量降低,但荧光动力学参数并无显著变化。抽穗期人工接菌表明,spl32对水稻白叶枯病菌抗性较对照显著提高。遗传分析表明spl32斑点性状由一个显性基因Spl32(t)控制,利用F2(02428/spl32)群体将其定位在第11染色体Ind-c和RM206之间,推测该基因为一个新的水稻斑点叶基因。     

水稻黄叶突变体ys94的鉴定与基因定位

水稻突变体ys94,是一个来源于化学诱变的叶色突变体。突变体在三叶期前出现明显的黄叶表型,叶绿素a、叶绿素b含量下降;透射电镜观察表明,突变体叶片叶绿体数量减少、类囊体片层退化。三叶期后叶色开始转绿。成熟期突变体ys94的分蘖数减少,但在结实率和株高等性状上与野生型相比并无明显差异。遗传分析表明,ys94的突变性状由一对隐性核基因控制。利用ys94×DJY组合的F_2定位群体,将突变基因定位在第8染色体短臂标记M8-3和M8-24之间,两标记间的物理距离为140kb,此区间包含11个候选基因。本研究结果为候选基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

水稻单叶独立转绿型黄化突变体grc2的鉴定与基因精细定位

转绿型叶色突变体是研究植物叶绿体分化与发育的基础材料。grc2是利用60Co-γ射线诱变籼型三系保持系T98B后获得的单叶独立转绿型黄化突变体。grc2植株上任一叶片刚抽出时为黄色,在生长10 d左右后变绿,具有单叶不依赖于植株特定发育阶段而独立转绿的特性。与野生型T98B相比,grc2黄化叶片的总叶绿素和叶绿素b含量显著降低,叶绿体滞留在黄化质体阶段,表明grc2可能在叶片早期发育中起关键作用。遗传分析表明,grc2受1对隐性核基因独立控制;利用源于grc2/Nipponbare的F2群体的960个突变单株,将grc2基因定位在STS标记S254与S258之间约31 kb的范围内,该区域含有5个未报道过的注释基因。这些结果为grc2的克隆及功能研究提供了重要信息。     

水稻早衰突变体es-h的鉴定、遗传分析与基因定位

水稻生殖生长期早衰严重影响水稻产量与品质。本研究利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变粳稻品种花晴稻(Hwacheongbyeo,野生型),获得了水稻生殖生长期叶片早衰突变体,命名为es-h (early senescenceHwacheongbyeo)。表型鉴定结果表明,该突变体从抽穗后开始叶片出现锈斑,随着灌浆进程急剧枯萎,到抽穗第五周整株枯死。农艺性状分析结果表明,与野生型相比,es-h突变体的抽穗期、穗长、穗颈度和有效分蘖数均无显著变化,而株高、每穗粒数、结实率及千粒重则显著降低。光合生理指标测定结果表明,es-h突变体抽穗后,其剑叶的SPAD值、叶绿素含量、Fv/Fm值及可溶性蛋白含量均急剧下降。遗传分析结果发现,es-h突变体的早衰性状受隐性单基因控制。通过基因定位将目标基因定位于第1号染色体长臂的44.2 kb物理区段上。本研究为Es-h基因的克隆及功能解析、早衰分子机制研究提供了依据。     

水稻斑马叶突变体zebra1349的表型鉴定及基因精细定位

从恢复系育种材料[R128//(R318/R1025)F1]F6中获得一个新的斑马叶突变体zebra1349,突变体秧苗期如果不移栽,与野生型一样表现绿色,移栽后5 d新抽出的叶片包括叶鞘会呈现出与叶脉垂直的黄绿相间的条纹,移栽后30 d抽出的叶片又表现正常绿色,成熟期主要农艺性状与野生型无明显差异。与野生型相比,突变体六叶期斑马叶黄区部位的总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量分别下降了55.86%、61.02%、39.34%和47.03%。透射电镜(TEM)观察表明,突变体斑马叶绿区部位叶绿体发育正常;黄区部位叶肉细胞中叶绿体结构异常,类囊体膜退化和分解严重,类囊体基粒片层数量明显减少,片层间距拉大,排列疏松。对zebra1349与正常叶色品种杂交F1、F2代的遗传分析表明该性状受1对隐性核基因调控。利用1192株zebra1349/02428 F2隐性定位群体,最终把ZEBRA1349基因定位在水稻第12染色体In Del标记indel39和indel44之间,其遗传距离分别为0.04 c M和0.17 c M,根据日本晴基因组序列推测,两标记之间的物理距离约为89 kb。本研究为ZEBRA1349基因的图位克隆和功能研究以及分子标记辅助育种奠定了基础。     

受光诱导的水稻突变体spl41的抗病鉴定及生理指标测定

为进一步研究水稻类病变突变体spl41的形态生理特征以及类病斑产生的原因和抗病性,对突变体spl41的种子进行表型观察和胚乳成分测定;同时对突变体spl41的叶片进行了遮光处理和接种病原菌实验,并测定了与活性氧(ROS)相关以及抗病相关的酶活。实验结果表明,突变体spl41的颖壳上具有红褐色斑点,但胚乳上无斑点。突变体spl41单株结实粒数较野生型HHZ降低了80%。此外,突变体spl41胚乳中的可溶性糖和可溶性蛋白含量分别较野生型HHZ下降了37.27%和13.89%,表明spl41突变体植株中胚乳的发育受到了影响。光可以诱导突变体spl41类病斑的产生,同时伴随着H2O2的累积。spl411突变体对稻瘟病菌生理小种GUY11、Y34和细菌性条斑病菌生理小种RS105具有广谱抗病性。spl41突变体叶片中CAT、POD、SOD的活性及MDA的含量显著高于野生型HHZ,说明ROS清除机制在spl411突变体中受到干扰,导致细胞受损和ROS的爆发;同时,PAL和PPO的活性在spl41突变体叶片中也显著高于野生型HHZ,这结果积极地响应了突变体spl41的抗病表型。     

水稻突变体的创制

为功能基因组学研究提供较好的基础材料,利用0.75%甲基磺酸乙酯溶液和γ射线双重诱变处理‘晋恢21’M1、‘中花11’、LR001种子进行研究。结果表明,经过M2筛选,获得716份叶、茎、穗、粒等性状变异的突变体,突变频率较高,达1.79%,还获得一些如不分蘖、多分蘖、白化苗、mini-plant、稀粒、花器官等极具研究价值的突变类型。双重诱变可以获得各种类型的突变体,所有的突变类型在3种材料中均有出现,说明该技术可为功能基因组研究提供大量的实物材料。     

水稻类病变坏死突变基因的RAPD标记

中籼3037诱变得到新的类病变坏死突变体Sp1801,以粳稻品种02428为父本与其杂交构建分离群体，并利用RAPD技术对此突变相关基因进行了遗传连锁分析，引物OPI 11和OPL 03扩增的稳定的差异片段与突变性状紧密连锁，两标记与目的基因的遗传距离分别为0．6cM和5．6cM，并且两差异片段分别为556bp和944bp，因此OPI11－556和OPL03－944可以作为此突变基因的RAPD标记。序列同源性分析表明，OPI11－556与一个抗稻瘟病基因pib有高度同源性。     

水稻短根相关基因OsKSR2的定位

根系是将植物固定于土壤及吸收利用水分和养分的重要器官。本研究从甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变的籼稻Kasalath突变体库中,筛选到一个水稻根系发育缺陷的突变体,命名为Osksr2 (Oryza sativa kasalath short root 2),该突变体植株整体矮小,主根、不定根和侧根的伸长都受到抑制。遗传分析表明该突变性状由1对隐性核基因控制,将该基因命名为OsKSR2。将Osksr2纯合体与粳稻日本晴杂交构建F₂群体,利用已经公布的水稻SSR标记和自行设计的STS标记进行基因定位,将OsKSR2定位在水稻第8染色体STS标记S27887与S27988之间约101 kb的范围内。通过水稻基因组注释系统共预测到17个开放阅读框(ORF),没有已知的与根系发育相关的基因。对OsKSR2的定位将为进一步克隆该基因和阐明水稻根系伸长的分子机理奠定基础。     

水稻类病变突变体c5的遗传分析与目标基因的精细定位

水稻类病变突变体c5是由粳稻品种中花11种子经化学诱变剂EMS (甲基磺酸乙酯)诱变处理得到的。该突变体叶片在三叶期开始出现近似圆形褐色斑点,经DAB染色和台酚蓝染色显示这些斑点积累了过多的H₂O₂并引起程序性细胞死亡。与野生型相比,突变体c5的成熟期株高从110.4 cm减少到74.6 cm,有效分蘖数和每穗着粒数分别减少23.7%和28.5%,千粒重和结实率都显著降低,此外,c5还表现出对白叶枯病菌的广谱抗病性,对10个菲律宾生理小种都有强烈的抗性反应。遗传分析表明,c5的突变性状受单隐性核基因控制。利用c5和明恢86配组形成的包含6269个单株的F₂群体和18个分子标记,将c基因限定在水稻第5染色体长臂STS标记S41和S47之间大约102 kb的遗传距离内。序列分析发现该区间内其中有11个编码基因,且它们与现已报道的类病变基因都不同,暗示c5可能是一个新型类病变性状控制基因。     

水稻多蘖矮杆突变体htd7(t)的遗传分析与基因定位

分蘖是水稻最重要的农艺性状之一,其决定水稻的最终产量。多蘖矮杆突变体htd7(t)是粳稻品种‘日本晴’经350 Gy 的60Co-γ射线辐射处理后产生的突变体。为了克隆HTD7(t)基因,将htd7(t)与‘9311’配制正反杂交组合进行遗传分析发现,htd7(t)多蘖矮杆性状是受1 对隐性核基因控制。利用SSR分子标记将HTD7(t)初步定位在第11 染色体分子标记RM21 与RM254 之间,遗传距离分别为5.6 cM和3.2 cM。利用已经公布的水稻基因组数据,在该基因附近新发展了13 对InDel 标记,对HTD7(t)进行精细定位。根据定位结果构建覆盖HTD7(t)基因的BAC 重叠群,最终将HTD7(t)定位在InDel11-3 和InDel11-5之间的64.8 kb的物理距离内。