转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5对土壤古菌丰度和多样性的影响

为探讨转基因玉米的生态安全问题,2015年分别于玉米拔节期、抽雄期、乳熟期和完熟期采集土壤样品,并采用荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism,TRFLP)技术,研究了转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植对土壤古菌丰度和多样性的影响。结果表明:转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5(TM)和受体玉米DBN318(PM)的根际土和非根际土古菌数量为1.41×10~9~4.04×10~9copies·g~(-1)土,随生长时期的推进均呈现先升高后降低的变化趋势,同一生长时期和土壤样品采集区域,2种玉米古菌16S rRNA基因丰度间无显著差异。T-RFLP分析共获得15种不同长度的T-RFs,其中89 bp和184 bp片段为优势种群,同一生长时期和土壤样品采集区域每种优势种群在TM和PM间均无显著差异。土壤古菌Shannon指数除PM非根际土呈现先降低后升高的变化趋势外,其他均表现为先降低后升高再降低;TM和PM根际土古菌Evenness指数的变化趋势均为先降低后升高,而非根际土古菌Evenness指数表现为先降低后升高再降低。同一生长时期和土壤样品采集区域TM和PM的Shannon指数间及Evenness指数间差异均不显著。冗余分析(Redundancy analysis,RDA)显示土壤总氮和硝态氮含量对古菌群落结构有显著影响。主成分分析(Principal component analysis,PCA)表明,TM和PM土壤古菌群落在根际土和非根际土中均未发生明显分离,说明TM和PM土壤古菌群落组成无显著差异。上述结果表明:转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤古菌丰度和群落结构组成与受体玉米DBN318无显著差异,古菌丰度和多样性主要受生长时期的影响,受土壤样品采集区域的影响不显著,土壤总氮和硝态氮是调控土壤古菌群落变化的关键因子。     

拟南芥抗寒基因ICE1的克隆及功能分析

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进化树表明,拟南芥ICE1基因与其他物种的ICE1基因差别较大。用农杆菌介导法得到4株阳性烟草植株,Southern blotting检测证明,ICE1基因已经以单拷贝的形式整合到烟草基因组中。实时荧光定量PCR检测表明,ICE1基因在转基因烟草植株的根、茎和叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量最高。4℃低温环境下,与未转化植株相比,转ICE1基因烟草植株叶片的相对电导率降低了12.00%~17.65%,脯氨酸含量增加了13.28%~24.10%,丙二醛含量减少了7.09%~14.52%,过氧化物酶活性提高了9.39%~22.54%。【结论】克隆获得了拟南芥ICE1基因的完整开放阅读框序列,在烟草中转入ICE1基因可提高其耐寒性。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物,将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端,同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术,从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接,利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选,然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆,成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas,然后将质粒转化至E.coli BL21感受态,设置不同IPTG浓度和诱导温度,选择最佳的表达条件,然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明,在pET28a表达载体中,Fas基因的插入方向和读码框均正确;同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的,融合蛋白分子质量为39.7 ku。     

新疆野生核桃 JfDREB1A基因的克隆与原核表达分析

为探究 DREB1A基因在新疆野生核桃响应低温胁迫中的作用及表达特性,以新疆野生核桃群体中的‘小矩圆’类型为试验材料,根据同源克隆的方法得到 JfDREB1A基因的cDNA全长序列,利用荧光定量PCR检测其在低温胁迫条件下的表达水平;将该基因片段重组到pET-28a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌（DE3）感受态细胞中诱导表达。结果表明,获得了新疆野生核桃中的DREB1A,将其命名为 JfDREB1A,该基因的开放读码框长度为645 bp,具有典型的 DREB1/CBF转录因子结构特征,JfDREB1A蛋白与其他植物DREB1蛋白具有高度保守性,与核桃亲缘关系最近。RT-PCR分析显示在4 ℃低温胁迫下, JfDREB1A基因的表达量迅速上调,8 h时达到最大。成功构建了pET-28a-JfDREB1A重组表达质粒,得到大小约为29 ku的融合蛋白,与预测蛋白大小相符,该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导2 h。     

猪NR4A1基因的克隆、序列分析及表达模式研究

【目的】克隆猪核受体4A1(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 1,NR4A1)DNA序列全长,并对CDS序列及其表达模式进行分析。【方法】以未成年长大母猪的卵巢为材料,采用电子克隆技术,对猪NR4A1DNA序列进行分离和测序,并对猪NR4A1基因序列进行生物信息学分析;利用性腺激素(人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)和孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin,PMSG))处理卵巢颗粒细胞,采用RT-PCR方法分析猪NR4A1基因的表达模式。【结果】获得猪NR4A1基因4 870bp的DNA序列,其中CDS全长序列为1 734bp,共编码572个氨基酸;猪NR4A1基因编码的氨基酸序列与人的对应氨基酸序列的相似性最高(97%),其次为小鼠(94%);Expasy软件预测结果表明,NR4A1蛋白的氨基酸序列非常保守,其中包含2个锌指特征(NR C4-type),一个是激素受体超家族,另一个是Zf-C4超家族;猪卵巢颗粒细胞在性腺激素处理后,可诱导猪NR4A1基因在卵泡发育和排卵时期瞬时表达。【结论】猪NR4A1基因的CDS区在物种间保守性较强,推测猪NR4A1基因调节卵泡的发育和排卵过程。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白CrylAc基因在虫生真菌球孢白僵菌中的表达

依据苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因序列设计引物进行PCR扩增,纯化产物与载体pbarGPE1连接,构建真菌表达载体pBARGPE1-Cry1Ac,通过芽生孢子转化法转入野生型球孢白僵菌中,获得多拷贝转化子;毒力测定结果表明转化子对马尾松毛虫的LC25比出发株降低5.4倍,LD25减少7.1倍,LT25缩短2.2 d,毒力明显提高;喂食处理和虫体喷雾喂食结合处理与单纯虫体喷雾处理相比,累计致死率分别提高了55.6%和63.0%,致死中时分别缩短了4.5 d和5.3 d。结果表明,苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因的表达显著提高了球孢白僵菌的毒力。这是Cry1Ac基因首次在虫生真菌中表达。     

红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

重叠延伸PCR法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究

【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

猪囊尾蚴MTsCL-1基因的原核表达

【目的】探讨原核表达猪囊尾蚴TsCL-1蛋白的生物学特性,为研究半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)在猪囊尾蚴与宿主相互关系中的作用奠定基础。【方法】将含有猪囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的pGEX-4T TsCL-1重组质粒转入大肠杆菌BL21进行表达,诱导后的重组菌裂解上清通过谷胱甘肽（GST）琼脂糖亲和层析法进行纯化,纯化产物利用明胶蛋白电泳法进行活性检测。【结果】经SDS-PAGE分析显示,猪囊尾蚴TsCL-1基因表达的重组蛋白相对分子质量约为61 ku,表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的57.4%。表达产物应用GST琼脂糖凝胶纯化后,纯化蛋白的纯度可达90%以上。明胶蛋白电泳结果显示,纯化蛋白对明胶具有水解活性,并且其水解活性能被半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂E-64抑制。【结论】从重组菌中成功表达了目的蛋白,该蛋白具有明显的水解活性,且E-64对其水解活性有抑制作用。