杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.     

中华鲟促甲状腺激素β亚基基因（TSHβ）cDNA序列的克隆及其表达分析

【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研究。【结果】克隆获得TSHβ基因,该cDNA序列全长649bp,5′和3′端非编码区分别为142和75bp;开放阅读框432bp,编码143个氨基酸。TSHβ亚基成熟多肽含有12个半胱氨酸(Cys)和2个N连糖基化位点。氨基酸序列多重比对表明,中华鲟TSHβ与促滤泡激素β亚基和促黄体激素β亚基的一致性分别为36%和35%,但与糖蛋白激素α亚基的一致性约为10%。与其他脊椎动物的TSHβ氨基酸序列进行比对发现,中华鲟TSHβ亚基与西伯利亚鲟一致性最高(98%);与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类的序列一致性分别约为44%,55%,56%和60%;脊椎动物TSHβ的Cys和N连糖基化位点位置高度保守。TSHβ亚基仅在中华鲟垂体中有表达;3龄雄性个体垂体中TSHβ的表达量约为1龄的9倍,3龄和5龄雌性个体垂体中的表达量均约为1龄的5倍左右。【结论】成功获得了中华鲟TSHβ亚基基因,该基因具有与其他动物TSHβ相似的结构和表达特征;雄性个体表达量高于雌性个体,其在中华鲟个体的生长发育过程中表达量上升。     

小麦条锈菌诱导的TaRRP4基因的克隆与表达

【目的】克隆小麦条锈菌诱导的小麦TaRRP4基因,研究其在小麦与小麦条锈菌互作、非生物胁迫、外源激素处理下的表达特征,为小麦与小麦条锈菌互作中该基因功能的验证及小麦抗病育种提供参考。【方法】以小麦品种水源11、小麦条锈菌生理小种条中23号（CYR23）和条中31号（CYR31）为材料,采用RT-PCR法,从小麦条锈菌侵染的水源11小麦cDNA中克隆得到1个外切体亚基TaRRP4基因,利用生物信息学对其序列进行分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析不同处理下TaRRP4基因在各个时间点的相对表达量,其中小麦条锈菌处理体系包含非亲和体系（CYR23与水源11）和亲和体系（CYR31与水源11）,非生物胁迫处理包含高盐、干旱、低温和机械损伤处理,外源植物激素处理包含脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯利和水杨酸处理,另外分析该基因在小麦不同组织（根、茎和叶）中的表达情况。【结果】克隆获得小麦TaRRP4基因序列,其开放阅读框为951 bp,编码316个氨基酸;同源氨基酸序列比对结果表明,TaRRP4与拟南芥AtRRP4p氨基酸相似度达62.96%,且均属于外切体亚基RRP4家族,包含类核糖体蛋白S1和KH 2个RNA结合结构域。qRT-PCR结果表明,与小麦条锈菌诱导0 h相比,小麦条锈菌CYR31诱导后,TaRRP4在诱导24,48和72 h极显著上调表达;而受小麦条锈菌CYR23诱导后,TaRRP4仅在诱导48 h显著上调,且上调倍数较小。与各个非生物胁迫小麦处理0 h相比,高盐胁迫下,TaRRP4在处理12和48 h分别极显著和显著上调;干旱胁迫下,TaRRP4在处理2和6 h均极显著上调表达;低温胁迫下,TaRRP4从处理2 h开始极显著或显著上调,直至48 h表达量降低;而机械损伤处理对TaRRP4的表达量没有显著影响。与各个外源植物激素处理小麦0 h相比,脱落酸可在处理12和24 h诱导TaRRP4下调表达,茉莉酸甲酯对TaRRP4的表达量没有显著影响,而乙烯利和水杨酸均可在处理2,6和12 h诱导TaRRP4上调表达。同时,TaRRP4基因在小麦根、茎、叶中均有表达,且在叶片中的表达量最高,显著高于其在小麦根、茎中的表达量。【结论】克隆得到小麦条锈菌诱导的小麦外切体RNA结合蛋白TaRRP4基因,该基因可能通过脱落酸、乙烯利和水杨酸信号交流,在小麦条锈病的防御反应中发挥负调节作用,同时在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中发挥重要作用。     

青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因的克隆与表达分析

【目的】对青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因进行克隆及表达分析,为揭示其在青海湖裸鲤生长和生理过程中的作用奠定基础。【方法】采用PCR和RACE技术克隆青海湖裸鲤中TOB1和TOB2基因的cDNA全长序列,对其特性进行了生物信息学分析。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测TOB1和TOB2基因在3龄成鱼肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织及发育12,72,120,168,216 h胚胎中的表达水平。【结果】青海湖裸鲤TOB1 cDNA全长为1 734 bp,5′非编码区为466 bp,3′非编码区为296 bp,开放阅读框长972 bp,编码323个氨基酸。TOB2 cDNA全长为2 785 bp,5′非编码区为51 bp,3′非编码区为1 582 bp,开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸。TOB1和TOB2在N端均具有明显的BTG家族结构域,且系统进化分析显示2个TOB蛋白与鲤科鱼类同源性较高,亲缘较近。qRT-PCR结果表明,TOB1和TOB2在3龄成鱼的肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织中均有表达;TOB1在3龄成鱼的心脏组织中表达量最高,其次为脑和肌肉组织,在鳃组织中的表达量最低;TOB2在3龄成鱼的脑组织中表达量最高,其次为肌肉。TOB1及TOB2在不同发育时期胚胎中均有表达,且都在12 h胚胎中表达量最高。【结论】TOB1及TOB2在3龄成鱼各个组织及胚胎中均有表达,但表达量有较大差异,表明2个基因均具有时空表达特异性。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

东方百合‘索邦’组蛋白去乙酰化酶基因 LoSorHDA1的克隆与表达分析

以东方百合‘索邦’（Sorbonne）为材料,结合前期转录组数据,克隆组蛋白去乙酰化酶基因HDA1(Histone deacetylases),命名为LoSorHDA1。LoSorHDA1序列长1 518 bp,编码505个氨基酸,生物信息学预测含有一个高度保守的组蛋白去乙酰化结构域。系统进化分析表明,LoSorHDA1与拟南芥等物种的HDA1同源蛋白聚为一支,而与HDAC家族其他成员关系较远;LoSorHDA1编码的氨基酸序列与单子叶植物小果野焦（Musa acuminata）的相似度最高,而双子叶植物HDA1则聚为另一支。RT-PCR结果显示：LoSorHDA1在‘索邦’不同组织中普遍表达,其中在茎生根、嫩茎、花被片、花丝、柱头、花柱、子房中表达量较高,在下部叶和花药中表达稍弱。亚细胞定位表达结果表明,LoSorHDA1定位在细胞核和细胞质中。荧光定量PCR结果显示：LoSorHDA1在不同花发育阶段中的各个花部组织中均有不同程度的表达,在雌雄蕊中表达趋势相反,而在内外花被片中的表达趋势较为一致,说明LoSorHDA1可能参与东方百合花发育进程,这为后续LoSorHDA1的去乙酰化修饰在百合花发育中的功能研究奠定基础。     

菊花CmPIN1同源基因的克隆与表达分析

以切花菊‘神马’(Chrysanthemum morifolium‘Jinba’)为材料,利用RACE技术与同源克隆方法获得菊花CmPIN1基因全长,通过qRT-PCR技术比较CmPIN1在不同组织器官的表达,同时对CmPIN1响应外施NAA和去顶进行研究。结果表明:1)CmPIN1基因ORF全长1 761bp,编码586个氨基酸,跨膜域位于蛋白N端与C端;通过蛋白序列比对分析,菊花CmPIN1蛋白与百日草ZvPIN1蛋白相似性最高;亚细胞定位结果显示CmPIN1位于细胞膜;2)对CmPIN1表达分析表明,该基因在菊花茎部与芽部具有相对较高的表达量,同时,在离体茎段中的CmPIN1受到生长素诱导;去顶后,CmPIN1表达量降低,而施加5μmol/L的NAA 6h后CmPIN1表达恢复;3)对菊花植株进行去顶试验表明,去顶后,近顶端第一个侧芽内CmPIN1基因表达量优先恢复,趋向于代替顶芽成为新的生长素源,以维持主茎中生长素极性运输;当主茎中的生长素运输通道再次打开,茎节中CmPIN1的表达量均逐渐恢复,其中,在近顶端第一个节间中CmPIN1的表达量恢复较缓慢。可见CmPIN1参与菊花主茎中生长素的极性运输,以及顶端优势的维持,间接抑制侧芽伸长。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

中国野生毛葡萄白粉菌诱导响应VqAP基因的克隆及表达分析

【目的】克隆中国野生毛葡萄"商-24"天冬氨酸蛋白酶(AP)基因的cDNA序列,明确其在葡萄抗病防御机制中的作用。【方法】在前期获得的中国野生毛葡萄株系"商-24"AP基因(VqAP)EST序列的基础上,采用RT-PCR克隆AP基因的cDNA序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR和半定量PCR,分析VqAP基因在白粉菌诱导不同时间(0,6,12,24,48,72,96和120h),不同激素(100μmol/L水杨酸,50μmol/L乙烯和0.5g/L茉莉酸甲酯)刺激及不同组织(嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须)中的表达情况。【结果】序列分析表明,VqAP基因序列长度为1 377bp,具有开放阅读框,编码458个氨基酸残基,相对分子质量为50.48ku,等电点为8.73。保守结构域分析表明,VqAP编码产物含有2个保守的具有催化活性的天冬氨酸残基,位于Asp-Thr/Ser-Gly(DT/SG)结构域,该基因编码的氨基酸序列属于植物天冬氨酸蛋白酶A1家族,为非典型的天冬氨酸蛋白酶。荧光定量PCR结果表明,接种白粉菌后6h,VqAP基因表达量为0h的6倍多,之后迅速下调;不同激素处理后,该基因也均诱导表达,这可能是由于VqAP基因参与了植物早期的抗病反应,以及由不同激素诱导的发病相关基因的调节作用。半定量PCR结果表明,在葡萄嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同组织中VqAP基因的表达量不同,这可能与它参与了植物不同组织中功能蛋白的合成与降解有关。【结论】VqAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

山葡萄VaCBF1转录因子基因的克隆与表达分析

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不同逆境胁迫(干旱、低温、盐胁迫)下的表达情况。【结果】成功地从山葡萄中克隆得到VaCBF1基因cDNA全长序列,其长度为762bp,编码253个氨基酸,在GenBank注册号为DQ517296。同源性分析证实,VaCBF1属于CBF转录因子家族。荧光定量PCR分析发现,低温胁迫可以诱导山葡萄VaCBF1基因高表达,而该基因的表达不受盐及干旱处理诱导。【结论】首次从山葡萄中克隆了VaCBF1基因,并证实该基因参与了植物对低温胁迫的应答。     

山葡萄类黄酮-5-O-葡萄糖基转移酶基因(5GT)的克隆表达及遗传转化分析

为探究5GT基因在山葡萄花色苷合成过程中的表达规律及作用,以山葡萄(Vitis amurensis)为材料,利用RT-PCR技术克隆山葡萄5GT基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为GU237133),将该基因命名为Vam5GT并对该蛋白进行生物信息学分析预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测Vam5GT基因在山葡萄8个不同转色时期的表达规律,将克隆获得的Vam5GT基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli Bl2(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。并构建表达载体pC5GT并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化。结果显示:克隆获得的Vam5GT cDNA全长1 497 bp,开放阅读框1 347 bp,编码448个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为49.84 ku,等电点为5.23,是不稳定蛋白。该基因属于UDPGT超基因家族,不包含信号肽。Vam5GT在山葡萄花后4周的果皮中表达丰度最高,其他时期表达逐渐下降;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,在含50 mg/L Kanomycin的培养基上对拟南芥T_0代种子进行筛选,先后得到2个阳性幼苗,转化率为0.05%。对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性。     

中国野葡萄锌指蛋白基因的克隆及生物信息学分析

【目的】在受白粉病菌侵染的中国野葡萄叶片中克隆锌指蛋白基因全长,研究葡萄抗白粉病的分子机制。【方法】在前期采用mRNA差异显示技术获得的中国野葡萄华东葡萄株系白河35-1抗白粉病基因表达差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列,并结合生物信息学方法对所获取的序列进行分析。【结果】该cDNA全长2663bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框,基因全长2223bp,编码1个由740个氨基酸组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),5′和3′非翻译区长度分别为395和44bp。多重比较分析表明,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻的C3H亚型CCCH型锌指蛋白的同源性分别为61%,70%和60%。【结论】利用RACE技术获得了锌指蛋白基因全长,为进一步研究锌指蛋白基因与葡萄抗白粉病的关系奠定了基础。     

大豆GmCYP85A2基因克隆与表达特性分析

【目的】克隆大豆GmCYP85A2基因并进行表达特性分析,为进一步研究GmCYP85A2基因的功能及其对大豆叶柄角的调控机制奠定基础。【方法】以郑豆196作为试验材料,利用同源克隆技术克隆GmCYP85A2基因,对其编码蛋白进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测GmCYP85A2基因在大豆植株不同组织（根、茎、叶片、叶柄、花、花芽和豆荚）及不同光照处理时间（0,4,8,12,16,20,24 h）下叶柄中的相对表达量,分析该基因的表达特性。【结果】成功克隆了大豆GmCYP85A2基因,其长1 524 bp,开放阅读框长1 401 bp,编码466个氨基酸;编码蛋白分子质量为53.4 ku,理论等电点（pI）为9.00,具有典型的P450超家族保守结构和蛋白三级结构,亚细胞定位结果表明该蛋白为分泌型蛋白。启动子分析结果表明,该基因转录起始位置ATG上游2 kb的基因组序列含有多个响应光照以及与生长发育、逆境胁迫相关的顺式作用元件。基因表达特性分析结果表明,GmCYP85A2基因主要在花、花芽、豆荚及叶柄中表达,且以花中的表达量最大;在营养生长时期,叶柄中GmCYP85A2的表达量受光照影响而上调,并伴随着叶柄角的变大。【结论】克隆了大豆GmCYP85A2基因,并研究了该基因的表达特性,分析了其在叶柄角调控中的可能机制。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

苋菜AtrADH2基因克隆及表达分析

ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以'苏苋1号'苏苋2号'苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371).结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为...     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

山葡萄无色花色素双加氧酶基因（LDOX）cDNA的克隆与表达

为获得山葡萄LDOX基因的全长序列,采用RT-PCR与SMART RACE技术克隆LDOX基因,并对该基因进行生物信息学分析。结果显示,山葡萄LDOX基因全长1 353bp,其中开放阅读框(ORF)为1 068bp,编码355个氨基酸,氨基酸序列的分子质量为40.19ku,等电点为5.61;VAmLDOX基因(GenBank登陆号:FJ645769)属于双加氧酶基因家族,不含信号肽,VAmLDOX蛋白属于不稳定亲水蛋白,二级结构中随机卷曲含量最高;山葡萄VAmLDOX氨基酸序列与欧亚种葡萄、苹果、大豆、三花龙胆和紫苏等的同源性系数分别为99%、81%、80%、77%和75%;半定量RT-PCR分析显示,在山葡萄果实着色过程中,VAmLDOX在不同时期的果皮中均有表达,在转色期的叶片、茎、果肉中也均有表达,且表达量相近。