一株淡剑灰翅夜蛾病原性真菌莱氏绿僵菌的多基因序列鉴定

为明确从草坪害虫淡剑灰翅夜蛾Spodoptera depravata(Butler)罹病虫体分离得到的病原性真菌菌株DT2011N7的分类地位,通过形态学观察、BLAST序列比对以及基于ITS、β-tubulin和rpb2a的单基因序列分析和3个基因联合的多基因序列分析对菌株进行了鉴定。结果显示,菌株DT2011N7在萨氏麦芽糖酵母浸粉培养基上培养时,菌落初期呈白色,产孢后表面密布孢子呈淡绿色;分生孢子为椭圆形,大小为3.5~5.5μm×2.0~2.8μm。BLAST序列比对结果显示菌株DT2011N7与莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi一致性最高,达99%~100%;在3个单基因及多基因系统进化树中,该菌株均与莱氏绿僵菌聚在同一进化分支中,自展值达99~100。结合形态学特征、同源性比对结果及系统进化树分析,将菌株DT2011N7鉴定为莱氏绿僵菌M.rileyi。     

绿僵菌蝗虫菌株Pr1蛋白酶基因的克隆及序列分析

从绿僵菌蝗虫菌株M2189克隆了昆虫表皮降解酶Pr1的基因。以特异性引物，分别进行了DNA-PCR和mRNA-RT-PCR反应，得到了预期扩增片段，回收纯化后通过pGEM-T载体转化大肠杆菌JM109，得到重组质粒，EcoR Ⅰ酶切鉴定表明目的片段已插入质粒。对重组质粒中插入的DNA片段进行了核苷酸序列测定，表明该序列全长1369bp，其中有3个内含子，分别为76、59、67bp；编码序列长度为1167bp，含有起始密码子和终止密码子，是一个完整的蛋白读码框。与菌株Mel得到的Prl编码序列（GenBank／M73795）相比，二者的核苷酸数目相同，同源性达到92．2％，编码的389个氨基酸中48个不同，占12．3％。     

绿僵菌研究的新进展

绿僵菌研究的新进展高松（中国农科院生物防治研究所，北京１０００８１）ＣＵＲＲＥＮＴＳＴＡＴＵＳＯＦＳＴＵＤＩＥＳＯＮＭＥＴＡＲＨＩＺＩＵＭＳＰＰ．ＧＡＯＳｏｎｇ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏ...     

绿僵菌高致病性菌株的筛选

用分离来自不同昆虫的绿僵菌,和同一菌株不同单孢子的分离体试验,对菜青虫致死率有明显差异。以“3305—6”菌株的致死率最高。致死率与培养基含氮量有关,以察氏培养基上的培养体致病力较高。     

椰子织蛾高毒力金龟子绿僵菌菌株的筛选

椰子织蛾是为害热带地区棕榈科植物的重要害虫,本试验对从海南省陵水县采集的椰子织蛾僵虫上分离得到的4株金龟子绿僵菌进行了分子生物学鉴定,并测定了其对椰子织蛾3龄幼虫的室内生物活性,筛选出了高毒力菌株LS-Y1。试验结果表明,经NCBI BLAST比对,4株菌株的rDNA-ITS序列与GenBank中已知基因序列相似性分别为99%、100%、99%、99%。菌株LS-Y1处理椰子织蛾3龄幼虫后6d的LC50为4.41×106个/mL。6.25×106、1.25×107、2.5×107、5×107和1×108个/mL浓度处理下,金龟子绿僵菌LS-Y1对椰子织蛾3龄幼虫的LT50分别为5.77、4.88、4.43、3.82和3.36d。该菌株对椰子织蛾幼虫具有较高毒力,具有较好的生防潜力。     

7株绿僵菌防治德国小蠊的毒力筛选

本文用7个绿僵菌(Metarhizium)菌株对德国小蠊Blattella germanica(Linnaeus) 进行注射生测,筛选出了一个致病菌株进行五代复壮选育。该株绿僵菌Metarhizitun anisopliae (Metsch)Sorokin复壮前对雌雄成虫注射生测LD50依次为13.2与8.9天;复壮后对雌雄成虫背部点滴生测12天的LDm值均为1.3×10~5孢子/虫。通过CP包埋剂制作石蜡切片对僵虫体内菌丝核和体表孢子堆进行了观察。     

绿僵菌IMI330189菌株突变体库的建立及毒力相关突变株的筛选

为了研究绿僵菌毒力相关的功能基因,采用农杆菌介导的转化方法将携带苯菌灵抗性标记基因的T—DNA导入绿僵菌IMI330189中,获得了绿僵菌突变体库,采用人工饲料诱饵法测定了突变株对3龄东亚飞蝗Locustamigratoria的毒力。研究发现,突变株对东亚飞蝗的毒力都有不同程度的改变,在诱饵剂浓度为10^8孢子．g-1下,野生型菌株IMI330189对东亚飞蝗的致死中时（LT50）为4-3d;突变株189-1的毒力略有提高,其LT50值为3．5d;其余突变株的毒力均降低,且突变株189—4、189—5、189—6、189—10、189-11、189—13和189—15几乎丧失了对东亚飞蝗的毒性,校正死亡率小于50％。本研究为进一步分离毒力相关基因、探索绿僵菌的致病机制奠定了基础。     

绿僵菌防治椰心叶甲的毒力菌株筛选

在室内用绿僵菌的分生孢子悬浮液喷洒椰心叶甲成虫和幼虫，检测了不同来源的21株绿僵菌菌株对椰心叶甲的致病力。初步试验结果表明，A类菌株中的MA2、MA4和MA9，B类菌株中的MB2、MIM、MB5、MB6和MB7等对椰心叶甲的成虫和幼虫均具有较理想的效果，处理5天后成虫和幼虫的平均僵死率可达95％以上。但由于A类菌株比B类菌株产孢快、孢子量多，所以对A类菌株的MA2、MA4和MA9菌株再做进一步的室内毒力试验。最终结果表明，MA4菌株对椰心叶甲的毒力相对是最高的，具有较大的开发利用价值。     

一株莱氏绿僵菌的筛选及其对草地贪夜蛾的毒力

开展草地贪夜蛾病原真菌的筛选和毒力测定可为草地贪夜蛾的绿色防控提供新的生物制剂.本研究从广西南宁田间采集的草地贪夜蛾幼虫僵虫上分离获得一株病原真菌,采用形态学和ITS-rDNA序列分析相结合的方法对该菌株进行了鉴定,并采用浸虫法测定了该菌株对草地贪夜蛾的致病力.结果表明新分离的菌株为莱氏绿僵菌Metarhizium r...     

绿僵菌无纺布菌条制作工艺

在接种优良液体种子的基础上，以单位面积的产孢量为指标，筛选了制作多种蛀干害虫的病原——绿僵菌无纺布菌条的最佳营养组合及培养条件。结果表明，最佳营养条件为（g／L）：白砂糖20g、黄豆粉40g、蛋白胨6g；琼脂含量对产孢量无显著影响；最佳培养条件为：25℃下，相对湿度（RH）95％，产孢量可达3．6×10^8～3．7×10^8孢子／cm^2。     

分子标记技术在绿僵菌研究中的应用

分子标记技术在真菌研究中被广泛应用,本文就其在昆虫病原真菌绿僵菌的分类、菌株鉴定等方面的研究、应用和存在的问题进行综述,并对其应用前景进行展望。     

绿僵菌对小菜蛾的感染反应分析

用绿僵菌孢子悬浮液中浸渍过的甘蓝叶喂饲小菜蛾的方法,测定小菜蛾对FI1248菌株的感染反应。运用时间-剂量-死亡率模型,对死亡率随时间和剂量的变化作了拟合。接种后第9天的LC     

绿僵菌治蝗研究进展

介绍了目前对防治多种蝗虫效果较好的虫生真菌--绿僵菌的种类、株系,以及绿僵菌对蝗虫的致病机理、 对环境的安全性等,并讨论了国内外应用绿僵菌防治蝗虫的田间试验效果、剂型研制、产业化和推广应用前景。     

金龟子绿僵菌黏附素基因mad1的敲除及功能分析

金龟子绿僵菌能够寄生昆虫,也能与植物共生。黏附素MAD1是绿僵菌与宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆虫的侵染和致病中起重要作用,但与植物的互作机制报道甚少。为了研究MAD1在绿僵菌与植物共生中的作用,我们通过同源重组构建了金龟子绿僵菌mad1敲除株,并检测了敲除株的生长、产孢、孢子萌发及毒力等生物学特性,进一步利用qRT-PCR分析了MAD1在调节花生免疫响应中的作用。结果显示,与野生型菌株相比,敲除株产孢量降低了43.67%,分生孢子萌发中时为27.69 h,显著长于野生型菌株的13.43 h。敲除株对家蚕的半致死时间LT₅₀为8.9 d,较野生型菌株的7.62 d显著延长。敲除株处理花生6 h后,花生免疫类基因CNGC1、PCD4,抗病基因SWEET10及转录因子WRKY41、MYB86的转录水平出现显著上调,而钙调素CML5、CML19的转录表达受到明显抑制。本研究证明了mad1是金龟子绿僵菌产孢、孢子萌发及毒力的正相关基因,并且MAD1在金龟子绿僵菌与植物相互作用初期,抑制植物抗性级联反应,减弱过敏反应,降低对微生物的抵御能力,同时增强共生信号的传导,这些...     

绿僵菌生物农药的研制与应用

绿僵菌生物农药的生产目前普遍采用液固双相发酵工艺,其固体载体多为大米及稻壳等材料,国内外的研究多集中于培养参数的优化与选择,如培养基成分、温度、光照、pH值、含水量及接种量等。绿僵菌制剂的剂型主要有粉剂、可湿性粉剂、干菌丝和油剂,其助剂的成分及配比是当前的研究热点。在应用方面,全球已登记的绿僵菌商品有17个,应用效果较好,防治对象集中于直翅目的蝗虫类、蜚蠊目、同翅目的蚜虫、粉虱、叶蝉类以及鞘翅目的蛴螬等害虫。本文从工艺研究、剂型研发、商品化及应用等角度对绿僵菌生物农药现状进行综述,重点介绍近年来的研究进展和新兴技术。     

绿僵菌侵染对黏虫免疫反应的影响

为揭示黏虫被病原菌侵染后的免疫应答机制,本试验分析比较了黏虫幼虫被金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae侵染后不同时间其血淋巴蛋白含量、免疫关键酶系(酚氧化酶PO,溶菌酶)活性、抗菌活力以及血细胞数量等免疫相关指标的变化。结果表明:受绿僵菌侵染后,黏虫6龄幼虫血淋巴蛋白含量在侵染初期(6 h和24 h)显著高于对照,侵染48、72和96 h后幼虫血淋巴蛋白质含量显著低于对照。且侵染后幼虫血淋巴PO活性也呈现先升高后降低的趋势,侵染初期(6 h和24 h)显著高于对照,侵染后期除72 h外与对照组无显著差异。侵染初期(24 h)溶菌酶活性也显著升高,随后出现下降,并于48 h显著低于对照,但在化蛹时(96 h)再次上升。绿僵菌侵染后期,黏虫的抗菌活性下降,于侵染后72 h抗菌活性显著低于对照,而侵染初期抗菌活性与对照无显著差异。另外,绿僵菌侵染对幼虫血细胞数量以及浆血胞比率也有显著的影响,表现为:侵染后6 h和24 h血细胞总数、浆血胞比率均显著高于对照,随后与对照并无显著差异。综上,绿僵菌侵染黏虫幼虫初期会显著诱导其免疫反应的启动,体现在主要免疫指标升高,而后随着免疫系统的破坏与能量的消耗,其免疫反应能力降低,生理活动受到干扰。     

5株绿僵菌对东亚飞蝗的毒力测定

在室内用点滴法测定了 5株绿僵菌对东亚飞蝗的毒力 ,结果表明 ,其毒力效果与菌株种类 ,接种剂量和温度有密切关系 ,菌株对东亚飞蝗的毒力为LA06>LB08>LC11>LF07>LD04。接种LA06菌株孢子量在 2.6×10⁴个/头下 ,对 4龄蝗蝻的LT₅₀为 3.91d。用不同剂量LA06接种 4龄蝗蝻时 ,发现其LD₅₀仅为26.67个/头。在设定剂量下 ,低龄蝻比高龄蝻和成虫更敏感 ,死亡较快。不同菌株在不同温度下的毒力不同 ,LA06在 30℃下比在 24℃下毒力强 ,而LD04和LF07在 24℃下比在30℃下毒力强。     

两株绿僵菌菌株的分离鉴定及其对花生蛴螬的致病力

从山东日照、青岛两地的花生生产示范大田采集得到天然罹病的花生蛴螬僵虫中,分离得到两株绿僵菌菌株（Metarhizium spp.）。对两株菌株的ITS1-5.8S rRNA-ITS2区域进行序列分析,并结合菌株的形态和培养特征,分别确定为平沙绿僵菌M.pingshaense（CQM132）和贵州绿僵菌M.guizhouense（CQM135）。筛选了菌株CQM132和CQM135的最适培养温度和最适培养基,结果表明两个菌株均在28℃温度条件下,在PPDA培养基上的生长速度最快且产孢时间显著最短。室内测定了菌株CQM132和CQM135对铜绿丽金龟和暗黑腮金龟幼虫（蛴螬）的致病力。结果表明,菌株CQM132和CQM135对铜绿丽金龟和暗黑腮金龟幼虫均具有较强的毒力。菌株CQM132的高浓度孢悬液（1.1×107～1.1×108孢子mL-1）对两种金龟幼虫的累计死亡率均达到85%以上,致死中时LT50≤7.58 d。菌株CQM135的高浓度孢悬液（1.1×107～1.1×108孢子mL-1）对两种蛴螬的累计死亡率均达到90%以上,致死中时LT50≤6.85 d。相比而言,菌株CQM135对两种蛴螬的致病力略优于菌株CQM132,可以作为优良菌株进一步研究。