DNA荧光染色法和培养法在支原体检测中的比较

[目的]为检测支原体寻求一种有效、快速的方法。[方法]分别运用DNA荧光染色法和培养法对原材料、细胞和生物制品中的支原体污染进行检测,并对检测结果进行比较。[结果]DNA荧光染色法能够快速、准确地检测出细胞中支原体的污染;培养法在支原体检测中需要的时间较长,但能有效地对原材料、细胞和生物制品中支原体污染进行检测。[结论]有效地检测支原体应根据待检样品的特性来筛选最合适的方法。     

寿光黑鸡成纤维细胞的体外培养与冷冻保存

[目的]建立鸡成纤维细胞的体外培养体系。[方法]用组织块法和消化法分别分离培养鸡皮肤成纤维细胞;比较细胞生长速率及冻存复苏率。[结果]酶消化培养的成纤维细胞原代生长较快,约5 d便可形成单层;2种方法传代细胞的生长速度相似,仅需2~3 d就可形成单层;使用酶消化法和反复贴壁法,经3~4代后,可获得纯化的成纤维细胞;成纤维细胞经冷冻复苏后有75%~80%存活;分离纯化的胚胎和皮肤成纤维细胞的生长曲线均正常,可传至12代,传代后染色体数目不变。[结论]采用组织块法及酶消化法培养鸡成纤维细胞均可获得ES细胞建系所需的饲养层细胞。该研究为ES细胞系的成功建立奠定了基础。     

欧拉羊胚肾细胞的分离培养和鉴定

[目的]分离培养并鉴定欧拉羊胚肾细胞,为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。[方法]用胰蛋白酶热消化法分离并培养欧拉羊胚肾原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。[结果]欧拉羊胚肾细胞呈成纤维型,复苏活力90%以上,生长良好,生长曲线呈"S",最大增殖浓度为4.61×105/ml,倍增时间26 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。[结论]欧拉羊胚肾细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

动物细胞培养物中支原体污染的检测

[目的]建立检测细胞培养物中支原体快速有效的方法。[方法]从6种常见污染细胞的支原体16sRNA中选择2段高度保守的核酸序列作为引物,用PCR和DNA荧光染色法来检测实验室中25种动物细胞株。[结果]用DNA荧光染色法检测实验室中25种动物细胞株阳性率为24％,可疑阳性为16％;而用PCR法检测阳性率为36％。[结论]PCR法较DNA荧光染色法灵敏度更高、特异性更强,将2种方法结合应用效果更好。     

兔成纤维细胞的分离与体外培养

用Ⅰ型、Ⅳ型胶原酶消化分离兔皮肤细胞,Ⅰ型胶原酶消化皮肤块获得的细胞数显著高于Ⅳ型胶原酶。用组织块直接培养法,也可以得到皮肤的原代培养细胞。２．５ｇ／Ｌ胰酶消化胎儿组织,可获得足够原代培养的细胞量。结合使用酶消化法和反复贴壁法,经２～３代后,可获得纯化的成纤维细胞。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。胎儿和皮肤成纤维细胞可分别传至第１３代与第１１代,传代后染色体数目不变。     

德国洋甘菊精油促进皮肤创伤愈合作用的研究

[目的]探讨不同浓度的德国洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)精油对成纤维细胞增殖和迁移的影响以及对小鼠皮肤创伤愈合的作用。[方法]用CCK8法检测不同浓度德国洋甘菊精油对成纤维细胞增殖的影响,用划痕法检测其对成纤维细胞迁移的影响,用小鼠切除伤模型检测其对小鼠创伤愈合的影响。[结果]结果表明德国洋甘菊精油可显著促进成纤维细胞增殖和迁移,其促进作用呈剂量依赖性;可显著提高小鼠皮肤创伤愈合速度,增加创面皮肤真皮厚度和成纤维细胞数目。[结论]德国洋甘菊精油能促进皮肤创伤愈合,其机制可能与促进成纤维细胞增殖和迁移有关。     

西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

[目的]以西藏黄牛胎牛为材料,建立西藏黄牛胎儿成纤维细胞系,为在西藏特殊生境条件下高原物种的动物克隆及其他细胞生物学研究提供理想的生物学材料。[方法]对西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法成功分离培养西藏黄牛胎儿成纤维细胞,对细胞的传代培养、形态学和动力学进行观察与分析。[结果]所建立的西藏黄牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏黄牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0-2 d、2-7 d、7-8 d,细胞群体倍增时期为60 h。[结论]成功培养了西藏黄牛胎儿成纤维细胞。     

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。     

二甲双胍抑制皮肤成纤维细胞活化的作用机制研究

为探讨二甲双胍抑制皮肤成纤维细胞活化的作用及机制,利用细胞实时分析检测系统检测二甲双胍对体外培养的皮肤成纤维细胞HFF-1增殖的影响,确定体外最适药物浓度;通过Real-time PCR检测二甲双胍对原代培养的硬皮病患者皮肤成纤维细胞中胶原及纤维化相关基因表达的影响,进一步检测二甲双胍对TGF-β诱导后的正常皮肤成纤维细胞HFF-1中纤维化相关基因表达的作用;通过Western blot检测二甲双胍对I型胶原蛋白表达的作用;通过Sircolassay检测二甲双胍对细胞上清中分泌的胶原蛋白的影响。结果表明:二甲双胍可抑制皮肤成纤维细胞增殖,且具有剂量依赖性;与对照组相比,二甲双胍可降低成纤维细胞中纤维化相关基因表达及细胞上清中胶原蛋白含量。此外,二甲双胍可显著下调TGF-β诱导的纤维化相关基因及胶原蛋白的表达。这一研究提示二甲双胍可能通过抑制成纤维细胞活化而抑制纤维化。     

欧拉羊胎儿皮肤细胞的培养、保存与鉴定

用胰蛋白酶对欧拉羊胎儿皮肤组织进行热消化分离并培养原代细胞，通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞，扩大培养至第3代时用液氮保存，复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。结果显示，欧拉羊胎儿皮肤细胞呈成纤维型，复苏活力93.5%以上，生长良好，细胞生长曲线呈“S”型，最大增殖量为3.31×10⁵ mL^-1，倍增时间为26.2 h；细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性，连续传代培养在10代内生长正常。表明欧拉羊胎儿皮肤细胞分离培养成功，使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

陶瓷复合膜分离工艺生产新生牛血清的研究

【目的】探索一次性过滤截留新生牛血清中细菌、霉菌、支原体等微生物及免疫球蛋白的工艺技术,为新生牛血清规模生产提供技术支撑。【方法】采用陶瓷复合膜分离生产新生牛血清,经细菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体、细菌内毒素等微生物及免疫球蛋白检测,并进行新生牛血清产品细胞培养试验。【结果】陶瓷复合膜能一次性成功截留新生牛血清中的细菌、支原体、细菌内毒素、BVDV抗体,过滤后细菌内毒素含量低于0.1EU/mL,免疫球蛋白去除率在97.00%以上;以其培养SP2/0细胞的细胞倍增时间、单克隆效率等指标接近于进口Hyclone胎血牛清水平。【结论】采用陶瓷复合膜分离工艺生产新生牛血清,实现了一次性有效过滤截留牛血清中细菌、霉菌、支原体等微生物及免疫球蛋白的目标,且能够满足细胞生长的营养需求,为大批量生产优质新生牛血清产品奠定了基础。     

陶瓷复合膜分离工艺生产新生牛血清的研究

【目的】探索一次性过滤截留新生牛血清中细菌、霉菌、支原体等微生物及免疫球蛋白的工艺技术,为新生牛血清规模生产提供技术支撑。【方法】采用陶瓷复合膜分离生产新生牛血清,经细菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体、细菌内毒素等微生物及免疫球蛋白检测,并进行新生牛血清产品细胞培养试验。【结果】陶瓷复合膜能一次性成功截留新生牛血清中的细菌、支原体、细菌内毒素、BVDV抗体,过滤后细菌内毒素含量低于0.1 EU/mL,免疫球蛋白去除率在97.00%以上;以其培养SP2/0细胞的细胞倍增时间、单克隆效率等指标接近于进口Hyclone胎血牛清水平。【结论】采用陶瓷复合膜分离工艺生产新生牛血清,实现了一次性有效过滤截留牛血清中细菌、霉菌、支原体等微生物及免疫球蛋白的目标,且能够满足细胞生长的营养需求,为大批量生产优质新生牛血清产品奠定了基础。     

新疆阿拉尔垦区猪嗜血支原体PCR检测方法的建立

[目的]掌握阿拉尔垦区猪嗜血支原体的流行现状。[方法]根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列（U88565）设计1对特异性引物,对采自新疆阿拉尔垦区的样品进行PCR扩增,并将其产物克隆到pBR322载体后测序。[结果]扩增出的片段为0.836 kb。同源性分析结果表明,该序列与猪嗜血支原体参考基因组序列同源性为99.47%,反映出我国分离株与国外株基因同源性较高。[结论]建立了一种猪嗜血支原体PCR检测方法,该方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段,并为相关基因的表达及功能研究奠定了基础。     

谷胱甘肽对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化功能的影响

【目的】研究谷胱甘肽(Glutathione,GSH)对奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus×O.aureus原代肝细胞增殖和生化功能的影响,探究谷胱甘肽的促生长作用机制。【方法】用添加φ为10%胎牛血清和未添加血清的培养液培养奥尼罗非鱼原代肝细胞48 h,随后在培养液中分别加GSH至0、30、100、300、900 mg·L~(-1),每个水平设6个重复,培养24、48和72 h后测定奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖情况及培养液中胰岛素样生长因子、白蛋白、过氧化氢含量和谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶活性。【结果】谷胱甘肽显著促进了奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖,提高了培养液上清中胰岛素样生长因子、白蛋白的含量和γ-谷氨酰转肽酶活性,降低了培养液上清中过氧化氢含量和谷草转氨酶活性(P0.05)。在无血清培养试验组中添加谷胱甘肽,对奥尼罗非鱼原代肝细胞增殖及生化指标的影响比添加血清培养试验组效果明显。【结论】谷胱甘肽能促进奥尼罗非鱼肝细胞增殖,且具有保护肝脏的作用。     

不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

[目的]验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞,通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显,都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用,与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。     

敖汉细毛羊体侧部与腹股沟部皮肤免疫基因的差异表达研究

[目的]从免疫基因中挖掘调控羊毛性状的候选主效基因。[方法]利用芯片技术,检测敖汉细毛羊体侧部与腹股沟部皮肤免疫基因的差异表达。[结果]差异倍数在2.0以上的免疫基因共46个,并对其中6个基因进行了实时定量PCR验证,其结果表明芯片数据和实时定量PCR验证结果相符率达66.67%,说明芯片数据是可靠的。[结论]免疫赦免机制可能参与羊毛的生长调控。