鸡新城疫病毒分离株细胞培养特性的研究

该试验对实验室保存的已适应于鸡胚的鸡新城疫病毒(NDV)分离株进行了鸡胚成纤维细胞(CEF)和仓鼠肾传代细胞(BHK21)的接种传代,同时利用96孔微量多孔板培养BHK21细胞单层,并在其上测定NDV分离株的细胞半数感染量(TCID50)。结果表明：NDV分离株在CEF和BHK21细胞上引起典型的细胞病变,细胞变圆、聚集、脱落,残留的细胞呈拉网状结构。NDV分离株在BHK21细胞上的TCID50为0．02mL 10^-6.75稀释的病毒液。     

二乙烯亚胺对猪细小病毒的灭活作用

使用新型灭活剂二乙烯亚胺(binary ethylenimine,BEI)对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)进行了灭活试验,通过ST传代细胞接种法观察病毒灭活后是否出现细胞病变,并结合血凝试验检测灭活效果,确定最佳灭活方法。用3～5日龄乳鼠检测BEI灭活后的病毒培养物和相应制备疫苗的安全性,并用豚鼠检测该灭活工艺制备疫苗的效果,与传统甲醛灭活进行了比较。结果显示,终浓度为1‰的BEI在32℃情况下经20 h即可彻底灭活PPV病毒;BEI灭活的病毒制备的疫苗免疫豚鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体。     

猪源睾丸传代细胞系传代培养的方法

猪源的睾丸传代细胞系(ST传代细胞系),具有传代方法简单,细胞系来源清楚,成分一致,细胞生长繁殖快,形成单层培养物早,适用于一些病毒的复制,已较多地应用于动物病毒学研究及疫苗生产中[1]。在猪细小病毒的研究和制备疫苗时,选定ST传代细胞系,在试验中观察到其适于该病毒繁殖,产生致细胞病变作用较快,复制的病毒滴度较高。     

犬细小病毒(CPV)内蒙古分离株的体外培养特性研究

采用F81细胞系作为传代细胞,对分离的CPV流行毒株进行培养,考察其培养特性及传代细胞毒的特性.结果表明,按1%同步接毒,CPV组织提纯毒在F81传代细胞株连续盲传6代后开始适应;以该细胞毒按2%同步接毒,继代8-14代,病毒能够得到稳定增殖扩繁,HA血凝效价可达到(1:256)～(1:1024),TCID,在103'8-100' 0.1/mL,而且细胞毒与CPV杭体有良好的血清学特异性;将不同较高代次细胞毒灭活后制备灭活抗原,以5 mL/只剂量对犬免疫,21 d后血清抗体效价可达到(1:16)～(1:32),表明制备的细胞毒免疫原性良好.从不同代次细胞毒的HA血凝效价和免疫杭体HI效价测定结果看,病毒传代扩繁以8～14代为宜.     

微载体培养ST细胞制备猪细小病毒灭活苗及其免疫原性分析

目的利用微载体规模化培养ST细胞制备猪细小病毒L株灭活疫苗,并检测其免疫原性。方法猪细小病毒L株接种微载体悬浮培养的猪睾丸传代细胞系(ST细胞)后,收获细胞培养液和细胞,经二乙烯亚胺(BEI)溶液灭活后浓缩,加矿物质油佐剂乳化,制备灭活疫苗,经肌肉注射疫苗,免疫后28天采血,测定血清中和抗体效价。结果。微载体规模化培养ST细胞制备猪细小病毒获得病毒毒价较高,经灭活浓缩后制备疫苗免疫豚鼠,获得了较高效价的中和抗体效价。结论利用微载体规模化培养ST细胞成功制备了具有较高免疫原性的猪细小病毒灭活疫苗,为后期灭活疫苗的开发奠定了基础。     

口蹄疫疫苗的悬浮培养工艺研究

通过生物反应器中进行BHK21细胞悬浮培养并逐级放大,分别接种口蹄疫OJMS/2000株与Asia 1/JSL株,纯化灭活后制备50批疫苗,结果均符合《口蹄疫O型、亚洲Ⅰ型二价疫苗(OJMS株+ JSL株)制造及检验规程》（以下称规程）所规定的各项标准,病毒146S抗原含量比转瓶培养提高10倍以上、疫苗的不良反应得到进一步改善.     

二乙烯亚胺对猪伪狂犬病病毒灭活效果研究

为研究二乙烯亚胺(BEI)对猪伪狂犬病病毒的灭活效果,使用终浓度为0.03%、0.04%和0.05%的BEI在30℃条件下对猪伪狂犬病病毒(DQ株)进行了灭活试验,通过ST传代细胞接种法观察病毒的灭活效果,用2~2.5 kg大耳白兔和断奶仔猪检测BEI灭活后的病毒液所制备疫苗的安全性,用小鼠检测该灭活工艺制备疫苗的免疫效果,并与传统甲醛灭活进行了比较。结果表明,终浓度为0.05%的BEI在30℃情况下经24 h即可彻底灭活PRV病毒;BEI灭活的病毒制备的疫苗接种大耳白兔和猪的安全性良好,免疫小鼠较甲醛灭活病毒能提供更高的保护率。本研究可为猪伪狂犬病灭活疫苗灭活工艺研究提供依据。     

悬浮培养在口蹄疫疫苗中的应用

通过生物反应器中进行BHK21细胞悬浮培养并逐级放大,分别接种口蹄疫OJMS/2000株与Asia 1/JSL株,纯化灭活后制备50批疫苗,结果均符合《口蹄疫O型、亚洲I型二价疫苗（OJMS株＋JSL株）制造及检验规程》（以下称规程）所规定的各项标准,病毒146S抗原含量比转瓶培养提高10倍以上、疫苗的不良反应得到进一步改善。     

鸡痘病毒在哺乳细胞内复制的研究

将重组鸡痘病毒在1种禽类细胞和13种哺乳动物及人的细胞内培养.通过电镜观察可见重组鸡痘病毒在CEE、BHK、PK、BTC、Vero细胞内的复制,同时用PCR方法扩增出目的基因,Western-blotting检测到目的蛋白,验证是鸡痘病毒.试验表明鸡痘病毒在禽类、个别哺乳动物细胞中可以复制,但尚未发现在人的细胞内复制;在CEF中可以稳定传30代以上;在BHK内第1代可以观察到细胞病变(CPE);在PK、BTC、Vero内第2代可以观察到CPE,证明鸡痘病毒在个别哺乳动物细胞发生复制,但不能稳定遗传.     

慢病毒介导siRNA抑制O型口蹄疫病毒ON株病毒复制

探究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对口蹄疫病毒复制的抑制作用,本研究选取O型口蹄疫病毒ON株,以ON株口蹄疫病毒3C、3D、VP1蛋白基因作为靶基因。对每一个靶基因设计并合成两对小片段发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)引物,分别命名为VP1-1、VP1-2、3C-1、3C-2、3D-1、3D-2,依据RNAi的原理构建6个shRNA的重组表达质粒,转染BHK21细胞后并接种ON口蹄疫病毒,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测筛选出能高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒;将能够高效抑制ON口蹄疫病毒复制的重组质粒进行慢病毒的制备并筛选稳定的BHK21细胞系,通过对TCID50的测定和使用实时荧光定量PCR的检测慢病毒干扰载体对ON口蹄疫病毒复制的抑制作用。结果显示,构建的6个shRNA重组表达质粒抑制率均在71.5%~93.2%,其中PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效果最为明显,分别为93.2%和90.8%;慢病毒干扰载体PLKO.1-VP1-2和PLKO.1-3D-1的抑制效率在88.3%~95.49%。对研究结果表明,在细胞的水平上挑选出有效抑制ON口蹄疫病毒复制的基因干扰片段,并成功制备慢病毒干扰载体,为后续抗口蹄疫病毒的转基因羊生产培育奠定了实验基础。     

鹿日本乙型脑炎的发病机理与防治

1病原日本乙型脑炎病毒属黄病毒属。病毒直径15~22nm,核芯为单股RNA,包以脂蛋白膜,表面有糖蛋白突出物。病毒对常用消毒药均敏感,50℃30min可灭活,但对低温和干燥有抵抗。本病毒可在Hela细胞、Detroit白细胞、猴肾等传代细胞以及小鼠、牛、人等胚胎细胞中繁殖。也可在小鼠、猴、马脑内接种后人工复制发病。     

利用RNAi抑制口蹄疫病毒的复制

根据口蹄疫病毒 IRES和 L 串联序列两侧的保守区域设计了 2个引物 ,利用 RT- PCR和 PCR方法扩增出该串联序列 ,并进行了测序。测序结果表明 ,扩增产物与 Gen Bank上相应的序列具有很高的序列同源性 (大于 99% )。在测序的基础上 ,选择了 L 基因上的 1个靶位点 (位于启始密码子下游第 2 2 9nt后 2 1 nt长的序列 ) ,合成了 si RNA表达盒SEC- L2 2 9。细胞单层长成 5 0 %～ 70 %时 ,将纯化的 SEC- L2 2 9转染到 BHK细胞中 ,转染 4 h后用高感染复数 FMDV接种 ,2 4 h后用间接免疫荧光方法对口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制进行检测。研究结果表明 ,SEC- L 2 2 9极大地抑制了口蹄疫病毒在 BHK细胞中的复制 ,且该抑制作用具有序列特异性 ,并降低了 BHK细胞的死亡率。另外 ,2 5 ng和5 0 ng SEC- L2 2 9处理组间对病毒复制的抑制作用差异不明显 ,可能是病毒基因组发生了突变。本试验表明 ,利用 PCR方法合成的 SEC在 BHK细胞中能特异性地抑制 FMDV的复制 ,RNAi技术可能为防治口蹄疫提供一个新的途径     

蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性研究

为研究蓝舌病病毒16型毒株在不同细胞中的增殖特性,本实验将BTV-16型毒株接种在BHK-21、Vero、C6/36传代细胞系及山羊肾原代细胞,通过细胞敏感性试验、病毒感染生长曲线以及qRT-PCR方法检测BTV-16型毒株在上述不同细胞中的复制效率和增殖情况。试验结果表明,BTV-16型毒株在BHK-21、Vero、C6/36及山羊肾原代细胞中均能增殖,但产生CPE的时间及病毒滴度有所差异。病毒在BHK-21、Vero细胞上病变较快,山羊肾原代细胞次之,C6/36细胞病变不明显。从病毒滴度和核酸检测结果来看,病毒在BHK-21细胞中的增殖效率与Vero细胞基本一致,并且病毒在这两种细胞中的增殖效率明显高于在山羊肾原代细胞和C6/36细胞。本试验为蓝舌病病毒分离、抗原制备、致病性以及反向遗传学研究提供了细胞学研究基础。     

山羊痘灭活疫苗研究

用对山羊痘病毒敏感的原代或次代牛睾丸细胞进行病毒增殖培养,从中筛选出一株进行培养,将获得的病毒液用二乙烯亚胺作为灭活剂制备病毒灭活疫苗接种山羊。分别在接种后7、14、21、28及72d采集血清用琼脂扩散试验进行免疫抗体检测,均检测到较强的沉淀抗体;在72d对山羊进行强毒攻击试验未出现山羊痘病理变化。实验证明疫苗安全性良好,制备的山羊痘灭活疫苗对山羊有较强免疫保护作用。     

复方术芩提取液体外抗PEDV感染PK-15细胞的作用效果

为探讨复方术芩提取液体外抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero细胞作用效果,以Vero细胞为宿主细胞,通过检测药物抗PEDV活性,计算其IC50和治疗指数TI,并从药物对PEDV的直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制、穿入抑制及复制抑制5个方面探讨复方术芩抗PEDV作用机理。结果显示复方术芩提取液能明显抑制PEDV的致病变作用,其IC50为17.41mg/L,TI为23.40。各浓度术芩提取液对PEDV病毒复制过程中均有一定的抑制作用,其中直接灭活作用和复制抑制试验效果比较明显,且质量浓度C=100mg/L,与病毒对照相比差异极显著(P<0.01),质量浓度C≥25mg/L,细胞保护率均超过50%。而阻滞试验、吸附抑制试验和穿入抑制试验,药物质量浓度需要达到100mg/L才出现显著的保护作用。表明复方术芩提取液在体外抗PEDV主要是通过对病毒的直接灭活和对病毒复制抑制而达到抗病毒功效。     

猪微小病毒灭活疫苗预防胎儿感染的试验

猪微小病毒(PPV)引起猪的流产、死胎不同于日本脑炎。作者研制了福尔马林灭活疫苗,用于预防胎儿的感染。疫苗用的病毒为PPV 90 HS株。培养于猪肾ESK传代细胞株细胞13代。接种ESK细胞置37℃培养7天后转入30℃环境加入0.2％福尔马林置7天灭活。灭活前的     

对虾副粘病毒样病毒的细胞分离培养

选用鲤鱼上皮乳状瘤细胞（ＥＰＣ）和虹鳟肝细胞（Ｒ１），对新发现的对虾暴发流行病病原副粘病毒样病毒进行了细胞分离与培养。结果证实对虾副粘病毒样病毒可在这２种鱼类传代细胞中复制，其中ＥＰＣ培养的病毒粒子的滴度在１０８／ｍＬ以上。     

利用组织培养制造狂犬病疫苗

利用组织培养能够繁殖狂犬病毒,引起了许多研究人员从事研制不含脑组织的抗狂犬疫苗。有些是以适应于原代地鼠肾细胞的固定毒制造的灭活苗。有些是以Flury鸡胚化弱毒株(LEP及HEP)制造的活毒苗。繁殖病毒或用鸡胚纤母细胞,或用人的二倍体细胞,或用乳地鼠肾细胞系(BHK21—C13)。也有用通过不同动物获得的弱毒株在猪肾细胞上繁殖制造的。本报告使用的病毒足通过HHK21C13     

金丝桃素的体外抗口蹄疫病毒活性

将体外培养的BHK21细胞感染FMDV后加入金丝桃素，日光灯下光活化1h，通过细胞病变观察、MTT法、透射电子显微镜观察、H^3-UR掺入试验，探讨了光活化金丝桃素对FMDV体外生长增殖的影响。结果表明，金丝桃素有明显的抑制FMDV致BHK21细胞病变效应，能抑制FMDV的增殖，抑制率可达61．82％。透射电镜观察，金丝桃素组与病毒对照组相比，BHK21细胞的FMDV颗粒明显减少。证实，金丝桃素在体外有明显的抑制FMDV增殖的作用。     

阿卡斑病毒培养特性和灭活疫苗免疫效果评估

为制备一种阿卡斑病毒灭活疫苗并初步评价其免疫效果，本研究应用组织半数感染量(TCID₅₀)测定的方法对阿卡斑病毒CX-01株在HmLu-1、Vero、BHK-21细胞上的扩繁规律进行判定，研究病毒在终浓度0.002 mol/L的BEI灭活剂、37℃条件下的灭活规律，然后应用ISA 206佐剂乳化制备疫苗，通过小鼠模型评估抗原中的添加剂蔗糖、海藻糖和左旋咪唑对免疫效果的影响。结果：HmLu-1细胞培养病毒效价最高为10^6.75 TCID₅₀/mL,优于Vero和BHK-21细胞；终浓度为0.002 mol/L的BEI灭活剂处理5 h即可完全灭活病毒，为确保对阿卡斑病毒的灭活完全彻底，在BEI灭活剂用量和灭活条件不变的前提下，选择最优的灭活时间为8 h;添加5%蔗糖、5%海藻糖、1%左旋咪唑的疫苗组免疫效果最好，平均中和抗体滴度为18.0。本研究结果对阿卡斑病毒的培养和灭活疫苗的制备具有一定的借鉴意义。