辣椒花器官发育以丹基因和PDS基因VIGS载体的构建及鉴定

以辣椒恢复系121C为材料．采用RT—PCR技术从121C花药中克隆得到控制花器官发育B类基因朋丹的部分序列，片段长379bp，阳性对照八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoenedesaturae，PDS），片段长323bp，然后通过酶切分别连接pTRV2质粒，获得重组载体pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。利用PCR进行初步鉴定后进行序列测定。结果表明，辣椒尉丹基因和PDS基因已插入到pTRV2载体上，VIGS载体构建成功。该研究为下一步分析基因沉默和辣椒花器官的发育提供了试验基础。     

TRV介导欧洲甜樱桃果实VIGS体系的建立

【目的】建立欧洲甜樱桃果实VIGS体系。【方法】利用In-Fusion cloning技术,构建欧洲甜樱桃的烟草脆裂病毒(TRV)介导基因沉默表达载体pTRV2-ANS,转入农杆菌GV3101中,采用注射压迫法侵染欧洲甜樱桃果实,通过分子检测、qRT-PCR和表型观察技术评价TRV介导VIGS沉默体系的效果。【结果】TRV::ANS侵染的欧洲甜樱桃果实ans基因的表达显著低于TRV::00侵染的果实。与TRV::00比较,TRV::ANS侵染的欧洲甜樱桃果实的果皮和果肉颜色都没有发生着色,果皮和果肉颜色呈绿色,而TRV::00侵染的欧洲甜樱桃果实的果皮和果肉正常着色。【结论】研究建立的TRV介导欧洲甜樱桃VIGS体系可有效沉默欧洲甜樱桃果实内源基因表达。该体系为欧洲甜樱桃果实品质基因的功能验证及分子机制研究奠定了技术基础。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是在桃（Prunus persica）上进行基因沉默的主要手段，现有VIGS体系效率较低，亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase）基因PpPDS为指示基因，探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明，在侵染方式上，叶片注射是有效的方式；李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）载体（pCaRNA1/2和pCaRNA3）优于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）改造后的TRV载体（pTRV1和pTRV2）；温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高；苗龄为5～6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高，达到85%；菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数，选择桃叶绿素合成基因（PpGluTR和PpPOR）为目标基因进行验证，结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制，叶片颜色变化明显。这些结果表明优化...     

利用VIGS技术研究草莓FaMYB5的功能

以‘丰香’草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonaka’)为材料,采用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)对果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子基因FaMYB5进行沉默,并对沉默后果实类黄酮化合物代谢途径相关的结构基因和其他转录因子基因表达量进行半定量RT-PCR及RT-qPCR分析。并分别采用HPLC和香草醛—硫酸比色法对沉默后果实中花青素苷和原花青素含量进行测定。成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS沉默载体,并建立了草莓果实VIGS沉默体系,FaMYB5基因沉默效率达60%;FaMYB5基因沉默处理与阴性对照相比,草莓类黄酮化合物代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FaMYB9、FaLAR、FaDFR、FaANR表达量显著增加,从而导致果实中原花青素含量增加;而花青素合成相关基因FaANS的表达量减少1/2,FaMYB10表达量变化并不显著。此外,bHLH家族的转录因子基因FabHLH3和FabHLH3Δ随着FaMYB5的沉默表达量显著下降,而FaGL3显著升高。结果进一步证明FaMYB5转录因子对草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径起负调控作用。     

杧果查尔酮合成酶基因(CHS1)的克隆与表达分析

【目的】克隆鉴定杧果CHS基因,分析其功能,明确杧果不同组织器官中CHS基因表达情况。【方法】以海南种植的6个杧果种的叶片总DNA和c DNA为模板,进行同源性PCR扩增,然后克隆到p MD18-T载体上,进行测序;通过生物学软件预测分析CHS基因编码的蛋白质;运用半定量PCR分析CHS基因表达情况。【结果】测序得到6个杧果种CHS基因c DNA全长为1 173 bp,CHS基因含有2个外显子和1个内含子。基于c DNA序列的NJ系统发育树显示,其与普通杧果(Mangifera indica)CHS1基因同源性最高。CHS1基因半定量表达显示杧果不同器官均表达CHS1基因,但在叶片和花中的表达量较高。【结论】克隆了杧果查尔酮合成酶1(CHS1)基因,半定量分析了杧果不同器官中CHS1基因的表达差异,为下一步研究提高CHS1基因的表达量奠定了基础。     

茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的克隆和功能分析

【目的】克隆草莓YUC家族新基因,探究其在草莓中的具体调控作用。【方法】以‘久香’草莓为材料,利用同源克隆技术克隆草莓果实大小调控相关的新基因,利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)结合定量RT-PCR技术,分析新基因在草莓果实膨大调控中的作用。【结果】从‘久香’草莓果实中克隆到1个草莓果实大小调控相关的新基因,命名为FaYUC11(Gen Bank登录号:JX417083.1),用草莓幼果微注射法建立了病毒诱导FaYUC11基因沉默的转基因草莓体系,结果发现,FaYUC11基因沉默后果实的膨大和正常生长均受到影响,并且导致果实瘦果(种子)中游离生长素含量下降、果实纵横径增长率降低。【结论】FaYUC11基因是草莓生长素合成途径中的关键基因,该基因通过调控生长素的合成继而调控果实的膨大。     

中国野生葡萄病原菌诱导响应VqSAP基因的克隆及表达分析

【目的】为了验证SAP基因在葡萄抗病防御机制中的作用,【方法】在前期通过抑制消减杂交技术(SSH)获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’衰老相关蛋白(SAP)基因EST序列的基础上,采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到SAP基因cDNA序列,并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了SAP基因的表达特异性。【结果】序列分析表明该基因具有完整的的开放阅读框,序列长度为819 bp,编码272个氨基酸残基,相对分子质量为30.56 ku,等电点为8.78,将其命名为VqSAP。多重比较结果显示VqSAP基因与油棕、玉米、萱草、拟南芥、水稻等植物SAP基因的同源性为65%~74%。实时定量结果表明,在白粉菌诱导初期,抗病的毛葡萄株系‘商-24’和感病的华东葡萄株系‘湖南-1’VqSAP基因表达量均升高,这可能是因为它参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程。水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(Eth)处理表明衰老相关蛋白基因表达受激素分子调节,但在抗病和感病株系中基因的表达量有所差异。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqSAP基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqSAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

香蕉MYB基因克隆和表达分析

【目的】获得香蕉抗逆相关转录因子。【方法】通过随机克隆测序的方法从香蕉根系c DNA文库中获得MYB基因,命名为Ma MYB1。【结果】对扩增获得的c DNA序列进行生物信息学分析,表明Ma MYB1是香蕉MYB基因编码框全长c DNA,包含一个951 bp的最大开放阅读框,编码一个长316个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的2个保守的MYB结构域R2和R3,属于典型的R2R3-MYB基因。系统进化树比对分析表明,Ma MYB1与海枣(XP_008808341.1)和油棕(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明该基因在叶、根和花中的表达量较高。实时荧光定量PCR分析表明Ma MYB1响应干旱、低温、盐和枯萎病菌的侵染等胁迫处理。【结论】Ma MYB1基因在香蕉响应逆境中扮演重要的调控角色。