茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

辣椒花器官发育以丹基因和PDS基因VIGS载体的构建及鉴定

以辣椒恢复系121C为材料．采用RT—PCR技术从121C花药中克隆得到控制花器官发育B类基因朋丹的部分序列，片段长379bp，阳性对照八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoenedesaturae，PDS），片段长323bp，然后通过酶切分别连接pTRV2质粒，获得重组载体pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。利用PCR进行初步鉴定后进行序列测定。结果表明，辣椒尉丹基因和PDS基因已插入到pTRV2载体上，VIGS载体构建成功。该研究为下一步分析基因沉默和辣椒花器官的发育提供了试验基础。     

番茄中维生素E合成相关基因的VIGS载体构建及侵染

以番茄为材料,采用RT-PCR技术从番茄果实中克隆了其体内维生素E合成相关基因—生育酚环化酶(Tocopherol cyclase VTE1)的部分序列,片段长420 bp,序列分析表明,该基因片段与番茄中生育酚环化酶cDNA序列同源性为95％,然后通过XhoⅠ、KpnⅠ 2个酶切位点连接VTE1片段和含PDS的pTRV2质粒,获得了重组载体pTRV2- PDS-VTE1,将该重组载体转化农杆菌GV3101,并侵染番茄.该研究为下一步分析基因沉默后的番茄中维生素E含量的变化提供试验材料;为今后通过转基因技术调节番茄果实的维生素E的合成奠定了基础.     

扁桃坐果率低的原因调查与分析

调查表明,花器发育不良、授粉树配置不当或无授粉品种、缺少传粉媒介及管理粗放,是造成扁桃坐果率低的几个主要因素。     

薄壳山核桃MADS-box基因CiMADS9的克隆与功能分析

以薄壳山核桃（Carya illinoinensis）‘马罕’雄花为材料,利用获得的MADS-box基因保守片段设计特异引物,通过RACE技术克隆MADS-box家族基因的cDNA序列,命名为CiMADS9。该基因长为1 077 bp,开放阅读框（ORF）768 bp,编码255个氨基酸残基。生物信息学分析表明该基因具有典型的MADS-box结构域和半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因。聚类分析分析表明该基因属于AGL15亚家族。实时荧光定量PCR结果表明,CiMADS9在生殖器官（雄花、雌花、幼果）中的表达量高于营养器官（叶、枝条）中的,并且在雄花中的表达量最大。将目的基因通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得了转基因植株。与对照相比,转基因拟南芥中过量表达该基因使植株开花延期,基生叶增加。     

基于牡丹类黄酮糖基转移酶基因建立VIGS技术体系

牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）花色的化学基础研究较为深入,但因其无遗传转化体系,导致花色相关基因的功能验证只能利用其他植物进行旁证。利用保守区段长分别为413和418 bp的牡丹花瓣类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT,通过VIGS表达载体,采用二因素三水平的试验体系对目的基因进行沉默。结果表明,PsUF3GT和PsUF5GT的表达量在花斑中（盛开期花瓣,真空抽滤15 min）和非斑中（蕾期花瓣,真空抽滤10 min）分别比空载体处理的花斑中（盛开期花瓣,真空抽滤10 min）和非斑中（蕾期花瓣,真空抽滤15 min）降低了65.0%和85.0%;花斑中总花青苷含量分别降低了24.2%和28.2%,尤其是盛开期花瓣（真空抽滤15 min）处理后3G型糖苷降低了92.2%,蕾期花瓣 （真空抽滤10 min）处理后3G5G型糖苷降低了54.9 %。由此获得了沉默PsUF3GT和PsUF5GT的适宜体系：以盛开期或者花蕾期带花柄的花朵为材料,抽真空渗透10 ~ 15 min后,置于去离子水中暗培养1 d（8 ℃,湿度60%）;之后转移至23 ~ 25 ℃、湿度60%的环境,光照培养3 d后可用于检测和分析。本研究中建立的VIGS体系可有效沉默花瓣中的内源基因,为牡丹基因功能验证及其花色形成的分子机制研究奠定了基础。     

珍稀濒危植物柄扁桃的花部特征比较研究

通过对2种柄扁桃花(白花和粉花)花部特征比较研究.结果表明:2种类型的花在花冠直径、花瓣长度、柱头高度等方面存在差异,而且白花的单花花粉量,花粉/胚珠比率(P/O)少于粉花.另外,白花的花粉活力和柱头可授性显著高于粉花(P0.05).     

扁桃AcSFB基因的克隆与原核表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。     

新疆野扁桃自交不亲和相关基因PetSSK1转“梦幻”矮牵牛的研究

以新疆野扁桃(Prunus tenella)花粉为试材,构建其自交不亲和性相关基因PetSSK1的植物表达载体pCAMBIA1303-PetSSK1,采用根癌农杆菌介导法,将该基因导入矮牵牛,并研究了不同种类及浓度抗生素对矮牵牛再生的影响。结果表明:该试验成功获得了转化新疆野扁桃自交不亲和相关基因PetSSK1的矮牵牛植株,并筛选出矮牵牛的卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)的敏感浓度分别为25、300mg·L~(-1),并进一步通过PCR分子检测确认其为转基因阳性植株。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

Cloning and identification of novel miRNAs in the flower organs of Korla fragrant pear at anthesis

The objective of the study was to learn more about some newly identified miRNAs related to calyx persistence in Korla fragrant pear (Pyrus sinkiangensis Yu). Small RNAs were subjected to high-throughput sequencing after extraction from the ovaries and sepals of flowers with either a deciduous or a persistent calyx. Differentially expressed miRNAs were screened, and 73 new miRNAs were obtained. Twenty of these new miRNAs were selected to further validate all of the new miRNAs. Their mature miRNAs were cloned and identified, the secondary structures of the precursor miRNAs (pre-miRNAs) were analysed, and then qRT-PCR analysis was conducted. The results showed that the mature sequences of nine new miRNAs (novel_miRNA) in different samples were consistent with the results of high-throughput sequencing. Overall, this study improved current methods for the molecular cloning and identification of fruit tree miRNA. Nine new miRNA types were identified. This study laid a good foundation for elucidating the biological functions of these new miRNAs.     

低温胁迫对油桃花器官膜脂过氧化和保护酶活性的影响

低温胁迫下油桃(Amygdalus persicavar.nectariana)花器官不同组织细胞膜透性变化趋势相似,即从缓慢增长到急剧上升之后缓慢上升。MDA含量随着低温胁迫的加剧也表现出相似的变化趋势。花器官不同,膜透性和MDA增加的幅度和临界温度不同。花器官各部分保护酶SOD、POD、CAT和APX活性,在低温胁迫前期均逐渐升高,在达到一定的临界低温后,呈现下降的趋势。这表明花器官内保护酶的存在和活性的提高减轻了由膜脂过氧化引起的伤害,是植物组织提高抗寒性、免遭低温伤害的重要原因。     

Influence of almond × peach hybrids rootstocks on flower and leaf mineral concentration,yield and vigour of two peach cultivars

Flower and foliar nutrient content of ‘Queen Giant’ and ‘Tebana’ peach [Prunus persica (L.) Batsch] on six almond × peach hybrids rootstocks (‘Adafuel’, ‘Adarcias’, ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Garnem’ and ‘Felinem’) were determined during one season. The mineral elements analysed were: N, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Na and Cu. Leaf N concentration in ‘Queen Giant’ was the highest on ‘Cadaman’ and ‘GF 677’ and the lowest on ‘Adarcias’. The P, Fe and Zn concentrations in flowers and leaves were significantly correlated. The leaf chlorophyll concentration at 120 DAFB was positively correlated with Fe floral concentration and with K, Zn and Na leaf concentration, in ‘Queen Giant’, and with K and Mn leaf concentration, in ‘Tebana’. In ‘Queen Giant’, the greatest trunk cross-sectional area was exhibited with ‘Felinem’ and ‘Garnem’ and the lowest with ‘Adarcias’. In contrast, the greater yield efficiency was found on ‘Adarcias’. In ‘Queen Giant’, a negative correlation was found between yield efficiency and Ca in leaves and in flowers. A positive correlation was observed between tree vigour and flower Fe, flower Ca and leaf Ca concentration. Correlation was also found between yield efficiency and Mg in ‘Tebana’ flowers. In ‘Queen Giant’, ‘Felinem’ rootstock showed the weakest balanced nutritional values (ΣDOP index) compared with other rootstocks.     

美国扁桃的整形修剪技术

美国栽培扁桃一般采用自然圆头形、杯状形、开心形等树形。幼树定干高度80cm左右，当新梢长达8－10cm时选择主枝。通常选留3个主枝。并在主枝上培养侧枝和结果枝。结果树每年要更新12％－20％的结果枝。适当短截一些结果力差的枝。衰老的树通过重截骨干枝和施氮肥促进树体生长。     

苹果MdRCD1基因的表达分析以及功能的初步鉴定

【目的】分离克隆苹果MdRCD1基因,分析其蛋白结构和逆境响应,并初步鉴定MdRCD1在苹果愈伤中的功能。【方法】同源克隆MdRCD1并测序,用DNAman和MEGA5相关软件分析MdRCD1氨基酸序列以及进化关系,不同逆境处理‘嘎拉’苹果组培苗,qRT-PCR分析MdRCD1在逆境条件下的表达量。农杆菌介导的遗传转化方法获得过量表达MdRCD1的转基因愈伤,不同盐浓度处理野生型和转基因愈伤,观察愈伤的长势,检测愈伤的鲜质量、脯氨酸和丙二醛含量,鉴定MdRCD1的初步功能。【结果】从‘嘎拉’苹果中克隆了MdRCD1(MDP0000234325)基因。该基因ORF为1 803 bp。通过进化树和蛋白同源性分析,表明苹果MdRCD1和中国白梨PbRCD1进化亲缘关系最近。在MdRCD1的N端有1个保守的WWE结构域,1个PARP催化中心,在C端有1个RST结构域。qRT-PCR实验表明MdRCD1在苹果各个组织器官中都有表达,在茎中的表达量高于其他组织;同时MdRCD1的表达受Na Cl、ABA、渗透胁迫等逆境胁迫的诱导。通过农杆菌侵染获得过量表达MdRCD1转基因苹果愈伤。盐胁迫处理条件下,过量表达MdRCD1的抗性明显提高。【结论】MdRCD1在进化过程中比较保守,苹果不同组织中都有表达,过量表达MdRCD1苹果愈伤的抗盐性得到提高。     

杜梨PbNHX1基因的克隆、表达分析及功能验证

【目的】克隆1个杜梨Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PbNHX1,并对其序列特征、表达特点及功能进行研究。【方法】采用RT-PCR和PCR克隆PbNHX1的c DNA和DNA序列,利用生物信息学方法进行序列分析,定量PCR检测其在非生物胁迫下转录水平变化,酵母互补试验检测PbNHX1基因的离子转运能力。【结果】杜梨PbNHX1基因c DNA编码区长1 704 bp,对应基因组DNA序列长3 594 bp,由13个外显子和12个内含子组成,编码蛋白含567个氨基酸。系统进化树显示,PbNHX1位于液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白分支上,与杨树液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白Pt NHX1.3基因亲缘关系较近。正常生长条件下,PbNHX1在杜梨叶片中表达量高于根。施加200 mmol·L-1Na Cl、10%(φ)PEG6000或100μmol·L-1ABA后,PbNHX1在叶片中的转录水平持续上升;其在根中的表达量先升后降,表达高峰依次出现在处理后6、3和6 h。PbNHX1的转入可恢复Na Cl、KCl和潮霉素B对nhx1缺失酵母菌株AXT3的生长抑制,转基因酵母细胞中Na~+和K~+含量显著增加。【结论】PbNHX1具有植物NHXs基因家族的固有特征,对盐碱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,转入该基因能够提高酵母nhx1缺失突变体AXT3对盐胁迫的耐受能力,部分恢复其对阳离子的转运功能,从而促进Na~+、K~+积累。