阔叶猕猴桃果实GalDH cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达

 以猕猴桃属植物中果实维生素C含量最高的阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia Merr. ) 果实为试 材, 经RT2PCR扩增获得约110 kb的L - 半乳糖脱氢酶cDNA片段。生物信息学分析表明, 该cDNA片段长为997 bp, 最大开放阅读框为960 bp, 可编码319 个氨基酸残基, 命名为A lGalDH, GenBank登录号为EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别在76%和70%以上, 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体pET-A lGalDH并转化大肠杆菌BL21, 经0.1 mmol·L ^{- 1} IPTG诱导, 获得具有较高活性的表达融合蛋白6 ×His-AlGalDH。经Ni-His亲和磁珠分离纯化, 获得单一的融合目的蛋白条带, 测定其酶活为120 pmol·min^{- 1} ·mg^{- 1}。     

猕猴桃AdCCS1基因的克隆及其表达调控

采用RT-PCR法从‘米良1号’猕猴桃中分离到1 066 bp的铜锌超氧化物歧化酶分子伴侣蛋白基因AdCCS1,登录号为KY471361。AdCCS1的开放阅读框为984 bp,编码327个氨基酸,包含3个典型结构域（N端结构域、中间结构域和C端结构域）和2个保守的金属结合位点（MXCXXC和CXC）。基因结构分析显示AdCCS1由6个外显子和5个内含子组成。系统进化分析表明AdCCS1聚在双子叶植物分支中,与茶树CsCCS的亲缘关系最近。此外,AdCCS1的5′端调控区存在多种光响应、胁迫响应和激素响应应答元件。定量PCR分析显示,AdCCS1在猕猴桃叶片中的表达量最高,其次是成熟果、花、幼果和茎,在根中的表达量最低。猕猴桃果实中AdCCS1在4 ℃低温贮藏过程中的表达量均比25 ℃贮藏中同期的低,说明低温抑制AdCCS1的表达。脱落酸和赤霉素处理后AdCCS1的表达下调,但二者的应答模式不同。     

猕猴桃PG基因在果实贮藏过程中的表达及其与硬度的关系

为鉴定猕猴桃果实贮藏过程中参与果胶降解的关键酶多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因,以‘徐香’猕猴桃为试材,利用转录组测序（RNA-seq）和实时荧光定量（qRT-PCR）技术,研究了猕猴桃PG基因在不同成熟进程及外源乙烯诱导后果实中的表达变化。根据RNA-seq结果,可以将37个PG基因在采后不同时期的表达趋势分为4类,Achn325011、Achn240441、Achn071601和Achn100411,分别在采后2、4、6和8 d有表达高峰。鉴于果实硬度在常温贮藏6 d较4 d时急剧下降,因此利用qRT-PCR重点验证了其中的2类14个基因,发现4个基因在采后2 d和4 d明显上调,与果实硬度在6 d时的下降相关。进一步利用外源乙烯处理果实,发现其中1个基因Achn071601在处理与对照果实中的差异表达与同时期果实硬度的变化趋势一致,是猕猴桃关键的PG基因。     

脐橙CsNAC基因的克隆及其在果实贮藏过程中的表达分析

从脐橙(Citrus sinensis Osbeck)果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,筛选了一个与NAC基因家族同源的EST序列,通过RACE技术成功克隆了CsNAC基因全长cDNA序列共1 203 bp,并对其进行了序列分析。结果表明,CsNAC包含一个918 bp的开放阅读框(ORF),编码305个氨基酸,预测的蛋白质分子量为35.2 kDa,等电点为6.72;CsNAC蛋白N端具有一个高度保守的NAC结构域;进化树分析表明CsNAC属于NAC蛋白家族的ATAF亚家族,可能参与胁迫反应。荧光定量PCR表达分析结果表明,CsNAC在果实贮藏过程中,随着果皮褐变的发生,与对照相比褐变果皮中的表达水平明显增强。说明CsNAC基因与脐橙果实的果皮褐变具有密切关系。     

猕猴桃MYB家族成员鉴定及其低温表达分析

通过对‘红阳’猕猴桃基因组鉴定得到277个MYB家族成员并将其分为12个亚家族（S1～S12）,其中多数序列属于R2R3-MYB,其次是MYB相关蛋白,仅鉴定到1个4R-MYB。S11和S12亚家族在进化上处于较早的位置,结构较为多样化,而S1和S2在进化上出现较晚。顺式作用元件分析显示,该家族主要含水杨酸、赤霉素和茉莉酸甲酯等相关植物激素元件,还有部分参与昼夜节律、低温、细胞周期等相关元件。密码子偏好性分析显示,猕猴桃MYB家族有3个高频密码子（UUG、AGA和AGG）,基因的密码子偏好使用A/T,第3位碱基偏好更强。通过顺式作用元件分析和4个猕猴桃品种越冬期转录组数据分析筛选了9个可能参与低温胁迫响应MYB基因,对其在低温胁迫下的软枣猕猴桃‘龙成2号’中进行检测验证,确认这些基因参与猕猴桃对低温的响应。     

毛花猕猴桃AeAPX基因家族鉴定与表达分析

【目的】鉴定并分析毛花猕猴桃（Actinidia eriantha）抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）)基因家族,为毛花猕猴桃抗坏血酸（ascorbate acid, AsA）代谢调控分子机制的探究提供参考。【方法】利用生物信息学方法对毛花猕猴桃APX基因家族进行鉴定和分析,并通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)验证分析AeAPXs在不同果实发育期中以及套袋处理后的表达情况。【结果】毛花猕猴桃全基因组中鉴定出29个AeAPX基因家族成员,随机分布在18条染色体上,并出现了基因片段复制现象。大多数基因被预测定位在叶绿体中。蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主,且有13个家族成员属于跨膜蛋白。AeAPXs家族具有相似的基因结构,大多数含有4个外显子且在上游启动子区域,分析发现,大量与光（Box4、G-Box）、激素（ABRE、TCA-element）逆境胁迫（MBS、ARE）响应相关的顺式作用元件。系统进化分析表明,AeAPXs基因家族可分为3个亚类,共存在6对共线性基因对。qRT-PCR...     

用保鲜剂贮藏猕猴桃果实的方法

常用猕猴桃保鲜剂有SM-8和SDF，现将其使用技术介绍如下，供参考。     

蝴蝶兰AP2/ERF家族基因的克隆及在低温下表达特性分析

用RT-PCR方法从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中克隆得到4个AP2/ERF家族基因,命名为PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4。蛋白结构域和序列比对发现PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4均含有1个AP2结构域, PhAP2/ERF2还含有1个B3结构域。进化树分析表明4个蛋白与兰科AP2/ERF家族成员亲缘关系最近,PhAP2/ERF1属于AP2/ERF家族DREB亚家族中的A1类,PhAP2/ERF2属于RAV亚家族,PhAP2/ERF3属于ERF亚家族的B4类,PhAP2/ERF4属于DREB亚家族中的A2类。用实时荧光定量PCR方法检测低温驯化和低温胁迫条件下PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4在‘大辣椒’和‘富乐夕阳’蝴蝶兰叶片中的表达特性,结果表明：4个基因在‘大辣椒’叶片中的表达趋势一致,表达量在低温胁迫早期达到最高,在胁迫中晚期有所下降;而4个基因在‘富乐夕阳’叶片中的表达趋势有较大差异,PhAP2/ERF1和PhAP2/ERF2的表达在低温处理整个过程中没有被诱导或仅有较小幅度增加,PhAP2/ERF3对低温的响应时间显著晚于‘大辣椒’,PhAP2/ERF4的表达趋势与‘大辣椒’差异较小。蝴蝶兰AP2/ERF在抗冷品种‘大辣椒’和不抗冷品种‘富乐夕阳’叶片中的表达差异暗示AP2/ERF基因家族在蝴蝶兰低温胁迫响应中起重要调控作用。     

猕猴桃果实氨基酸及其变化的研究

对猕猴桃属(Actinidia)的10个种、5个品种、9个杂种在不同栽培条件下、不同授粉品种及不同采收期果实的氨基酸含量进行了4年的反复测试,观察到猕猴桃果实中含有17种氨基酸,其中有8种是人体所必需的.它们的含量差异较大.杂种F_1代氨基酸含量高低受亲本遗传基因所控制.     

猕猴桃果实不同部位间果实品质的差异性分析

为探究猕猴桃果实不同部位间主要果实品质的差异,以猕猴桃品种'红阳'金果'金艳'为试材,通过套袋和未套袋处理,测定其果实不同部位间主要果实品质并进行差异性分析。结果表明:不同猕猴桃品种间果实主要品质存在较大差异,同一品种其果实不同部位的主要果实品质也存在较大差异;未套袋处理的'红阳'果实以其上部(果基)综合品质最佳,'金果'为下部(果顶),'金艳'为中部;套袋处理后,'红阳'以果实中部综合品质最佳,'金果'为上部,'金艳'为下部。据此,在对果实品质进行测定时,建议各部位均匀混合取样或者取相同部位的样品;套袋试验结果表明,套袋能增加'金果'猕猴桃干物质含量,提高'金艳'猕猴桃采摘期外果皮的硬度,且能促进'金果'和'金艳'猕猴桃软熟期的着色。     

黔南州野生美味猕猴桃果实生长发育规律

以黔南州野生美味猕猴桃为试材,通过定期测量野生美味猕猴桃果实的生长状况,并对定期采集野生美味猕猴桃果实样品进行还原性总糖和氨基酸总量的测定,对野生美味猕猴桃的果实生长发育规律进行了研究,为野生美味猕猴桃资源的保护和开发利用提供科学依据。结果表明:3组野生美味猕猴桃的果实坐果率各不相同,6—8月为野生美味猕猴桃体积的快速增长期,之后缓慢增长;干物质含量在6月中旬至10月持续增长,还原性总糖含量6—8月维持相对较低的水平,进入9月后快速增长;氨基酸含量整体呈低-高-低的变化规律。说明野生美味猕猴桃因所处的自然环境条件的不同其坐果率、果实大小等差异较大,6—8月为果实体积的快速生长期,8月16日以后随着干物质和糖等含量的增加,果实品质逐渐改善。     

三种夏季修剪方法对“海沃德”猕猴桃生长及结果的影响

以8年生"海沃德"猕猴桃品种为试材,设置了强旺结果枝在结果部位之上留3~4叶进行摘心、强旺结果枝在结果部位之上留7~8片叶进行摘心和强旺结果枝进行捏尖控长等3个处理,通过枝蔓生长量、二次梢的发生率、翌年枝萌发率、结果能力、劳动力投入等的调查及叶片相关指标、果实品质指标测定,研究了不同夏季修剪方法对猕猴桃生长及结果的影响。结果表明:枝蔓夏季修剪以捏尖处理劳动力投入少,果实产量高,质量好,翌年结果能力强,综合效果最优;强旺结果枝结果部位以上留7~8叶摘心与捏尖处理在树体翌年萌芽、结果能力无显著差异,但是劳动力投入(二次梢发生率)较高,品质较差,综合效果次之;强旺结果枝结果部位以上留3~4叶摘心处理的劳动力投入(二次梢发生率)最高,果实产量较低、品质较差、翌年萌发、结果能力差,综合效果最差。说明枝蔓夏季修剪以捏尖处理最适合"海沃德"猕猴桃的生长。     

彩色猕猴桃与美味猕猴桃的遗传差异分析

彩色猕猴桃(Actinidia deliciosa var．coloris)为美味猕猴桃(A．deliciosa var．deliciosa)的红心变种,数量稀少,十分珍贵,是中国特有的种质资源,具有重要的育种价值。采用RAPD技术研究彩色猕猴桃红美,TJ-DD—19,TJ- DD-54,TJ—DD-75和Ckou—DD-18的遗传多样性,以及它们与3个有代表性美味猕猴桃品种川猕1号,秦美和海沃德的遗传差异性。从120个引物中筛选出扩增效果较好的18个引物,共扩增出242条带,其中多态性带206条,占85．1％。各引物扩增的条带数在5～18条不等,平均每个引物扩增出的带数为13．4条。结果表明,彩色猕猴桃和美味猕猴桃具有复杂的遗传关系,它们除了变种间具有较大的遗传差异外,变种内也存在一定的遗传差异。同时,采用UPGMA法聚类的结果与传统的形态分类存在一定的差异,但部分反映了猕猴桃的地理分布。     

中国芦荟AIDREB2基因的克隆及其胁迫表达

为了研究中国芦荟的抗逆机理,以cDNA为模板,利用3'RACE和PCR扩增方法,克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因,命名为AlDREB2,GenBank登录号为FJ560460.其cDNA序列全长为886bp,包含一个636 bp的开放阅读框,推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸)与库拉索芦荟AlDREBI的序列相似性很高.进化树分析结果将AlDREB2归入DREB亚家族中A-6亚组.利用RT-PCR技术分析了AlDREB2基因的表达与胁迫的关系,表明AlDREB2基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达.     

中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达

 为了研究中国芦荟的抗逆机理, 以cDNA为模板, 利用3′RACE和PCR扩增方法, 克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因, 命名为AlDREB2, GenBank登录号为FJ560460。其cDNA序列全长为886bp, 包含一个636 bp的开放阅读框, 推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸) 与库拉索芦荟AlDREB1的序列相似性很高。进化树分析结果将AlDREB2 归入DREB 亚家族中A26亚组。利用RT-PCR 技术分析了AlDREB2 基因的表达与胁迫的关系, 表明AlDREB2 基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达。     

水仙温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL的克隆与表达分析

采用PCR法,从水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）鳞茎主芽中分离克隆到1个温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL。该基因含有567 bp开放阅读框,编码188个氨基酸。该基因属于lipocalin-2 superfamily基因家族;推导的氨基酸序列含有SCR1、SCR2和SCR3 3个植物lipocalin的典型结构域,与小麦、拟南芥等植物的同源性大于75%;编码的蛋白为稳定酸性亲水蛋白,不含有信号肽,进行N末端朝外由外到内的跨膜运动。qRT-PCR结果分析表明,水仙生长发育过程中鳞茎膨大期NtTIL表达量较低;休眠期表达量先升高后降低。推测NtTIL对水仙鳞茎主芽休眠具有一定调控作用。     

夏橙果实离层中伤害诱导基因的克隆与表达分析

从乙烯处理的伏令夏橙果实离层中克隆出4个伤害诱导基因(CsWIP1、CsWIP2、CsWIP3、CsWIP4)。通过RT-PCR、RACE等克隆技术分别获得了CsWIP1、CsWIP2、CsWIP3和CsWIP4的全长cDNA。测序结果表明CsWIP1、CsWIP2、CsWIP3和CsWIP4全长cDNA分别为588、549、412和629bp,开放阅读框分别编码98、95、83和88个氨基酸,结构模拟显示这些蛋白在C-端和N-端各有一个α-螺旋,中间是一个富丝氨酸域。与其他植物伤害诱导蛋白序列比对结果显示,CsWIP家族蛋白分为2类,CsWIP1、CsWIP2和CsWIP3与玉米WIP家族中NP_001148450.1、NP_001151919.1、NP_001151459.1、NP_001147041.1和拟南芥NP_192765.1、NP_849355.1、NP_179023.1聚成一类;CsWIP4与葡萄的AY159560.1聚成一类。通过实时定量PCR检测这些基因在乙烯处理下果实离层中的表达情况,结果显示CsWIP1和CsWIP2受乙烯强烈诱导,CsWIP3和CsWIP4几乎不受乙烯调控。     

中华猕猴桃与美味猕猴桃生物学特性及生产性能比较

通过对中华猕猴桃与美味猕猴桃物候期和生长结果习性的观察,发现中华猕猴桃物候期早于美味猕猴桃;短、中、长果枝和徒长结果枝所占的百分比,前者平均分别为50.1%、36.7%、12.7%和0,后者为11.1%、19.1%、47.9%和22.0%.说明中华猕猴桃以短果枝结果为主,美味猕猴桃则以长果枝结果为主.在产量和果实品质上,两者亦有显著差异.中华猕猴桃表现为:结果早、前期产量高、早熟和果实维生素C含量高,果实耐藏力和商品性不及美味猕猴桃.     

Molecular cloning of three malic acid related genes MdPEPC, MdVHA-A, MdcyME and their expression analysis in apple fruits

Malic acid (MA) in apple fruit is the predominant organic acid associated with taste, flavour and juice quality. In this study, three full-length cDNAs of MdPEPC, MdVHA-A and MdcyME were cloned from apple fruit. They encoded cytosolic phosphoenolpyruvate carboxylase (MdPEPC, EC 4.1.1.31), subunit A of vacuolar H⁺-ATPase (MdVHA, EC 3.6.1.3) and cytosolic NADP-dependent malic enzyme (MdcyME, EC 1.1.1.40), respectively, for MA synthesis, transportation and degradation. Real-time quantitative PCR discovered that the expression levels of three genes varied with development stages, and that their expression patterns differed between low acid (LA) and high acid (HA) genotypes. In addition, enzyme activity assay showed that PEPC and VHA contributed positively to MA accumulation during fruit development both in LA and HA, while cyME did negatively.