除草剂酶联免疫吸附测定研究进展

酶联免疫分析技术具有方便快速、特异性强、灵敏度高等优点,近年来广泛应用于农药残留检测.本文介绍了酶联免疫分析技术在除草剂残留检测中的应用研究进展,分别介绍了各类除草剂的半抗原合成方法以及抗体的灵敏度,探讨了酶联免疫吸附分析法存在的问题和应用前景.     

酶联免疫吸附技术——Ⅲ酶联免疫吸附法在检测植物病毒上的应用

一、酶联免疫吸附法(ELISA)概述1966年 Nakane 等及 Avrameas等,分别报道用酶代替荧光素标记抗体,作生物组织中抗原的鉴定及定位。随后发展用于鉴定免疫扩散及免疫电泳板上的沉淀线。Miles(1968)等描述了如何在免疫测定中用酶代替同位素。Avrameas(1969,1971)试验使抗体与酶结合,并进行了检测抗原的基础试验。继而由     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

快速检测大豆疫霉菌的酶联免疫吸附技术研究

利用已经制备的大豆疫霉菌的抗血清，对大豆疫霉菌的纯培养和大豆病组织进行检测。结果表明：间接法（Ｉ－ＥＬＩＳＡ）和夹心法（ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ）都能较好地检测纯培养的大豆疫霉菌，但在检测病组织时，夹心ＥＬＩＳＡ的特异性较强，能够可靠地检测到大豆病组织内的病原菌     

快速检测大豆疫莓菌的酶联免疫吸附技术研究

利用已经制备的大豆疫霉菌的抗血清，对大豆疫霉菌的纯培养和大豆病组织进行检测。结果表明，间接法（Ｉ－ＥＬＩＳＡ）和夹心法（ＤＡＳ－ＥＬＳＩＡ）能较好地检测纯培养的大豆疫霉菌，但在检测病组织时，夹心ＥＩＳＡ的特异性较强，能够可靠地检测到大豆病组织内的病原菌。     

酶联免疫吸附技术—Ⅰ酶联免疫吸附法(ELISA)实验技术

从植物检疫的任务着眼,为了防止传染性病害的传入和散布,早期准确诊断是十分重要的。由于这个原因,高度敏感和特异性强的血清学诊断方法已经得到广泛的应用。随着免疫学理论的进展,血清学实验技术也有很大发展,主要表现在抗原、抗体纯化,操作技术的微量化、自动化、标准化,以及荧光素、同位素、特别是酶标记抗体球     

溴氰菊酯酶联免疫吸附分析方法研究

建立了定量测定溴氰菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。合成了半抗原1-羧基-(3'-苯氧基苯基)甲基-3-(2',2'-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙基羧酸酯(Med)和N-2-(羧基丙基)氨基甲酰基-(3'-苯氧基苯基)甲基-3-(2',2'-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙基羧酸酯(Di)。分别采用碳二亚胺法和混合酸酐法将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了免疫原Di-BSA和包被原Di-OVA、Med-OVA。将制得的溴氰菊酯免疫原免疫动物获得多克隆抗体,经间接非竞争ELISA法测得其效价为2.5×105。通过对甲醇含量、离子强度、pH值等影响因素进行异源分析条件的优化,确立了溴氰菊酯间接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件(30%甲醇、氯化钠0.4 mol/L、pH 7.5),并建立了标准竞争曲线。该方法的IC50值为0.55±0.05 mg/L,检测限(IC10)为3.76±0.35 μg/L,对大多数拟除虫菊酯无交叉反应。分别在自来水、河水和土壤样品中添加0.05 ~5.0 mg/L(或mg/kg)的溴氰菊酯,回收率分别为89.7% ~106.8%、82.4% ~101.7%、75.6% ~97.8%。     

酶联免疫吸附试验方法的比较

应用白背飞虱单克隆抗体比较了３种酶联免疫吸附试验方法。结果表明：间接酶联免疫吸附试验的灵敏度高于直接酶联免疫吸附试验,分别为０．０３１２５μｇ蛋白／ｍｌ（相当于１／２５６头成虫）和０．０６２５μｇ蛋白／ｍｌ（相当于１／１２８头成虫）,而双抗夹心酶联免疫吸附试验无法使用。样品中非目标抗原（捕食者）浓度对检测结果有显著的影响,且对直接酶联免疫吸附试验的影响更大,检测时必须对样品做适当的稀释     

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定甘蔗中的克百威残留

采用包被抗体直接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定了甘蔗中的克百威残留量。在优化条件下,对克百威标样检测的线性范围为0.000 1~1 mg/L,抑制中浓度(IC50)=3.09 μ g/L,5次重复测定的相对标准偏差(RSD)为9.3%, IC20值为0.085 μ g/L。甘蔗中分别添加克百威标样1,0.1,0.01 mg/kg,直接竞争ELISA法测定的回收率分别为86.3% ~99.1%,89.0% ~101% 和70.7% ~90.6%,RSD(n=5)分别为5.4% ,5.2% 和10.7%。ELISA法对甘蔗中克百威残留的最小检出量为6.3×10-11g,定量限可达1.26 μ g/kg。而同样前处理条件下高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)法对克百威的最小检出量为5×10-8 g,检测甘蔗中克百威残留的定量限仅为2.5 mg/kg。     

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定小白菜中溴氰菊酯的残留量

应用作者所在实验室自制的、对溴氰菊酯具有特异性亲和力的多克隆抗体和酶标半抗原,建立了包被抗体-酶标半抗原直接竞争酶联免疫吸附分析法(DC-ELISA)。小白菜样品经超声提取、浓缩和10%甲醇定容后采用DC-ELISA法测定,并采用高效液相色谱法进行验证。结果表明:在抗体包被浓度为2.0 mg/L、辣根过氧化物酶(HRP)标记溴氰菊酯半抗原稀释2.0×105倍、包被介质为pH 7.2 PB、反应介质为含0.125 mol/L NaCl pH 6.8 PB的优化条件下,DC-ELISA法检测溴氰菊酯的线性范围为0.10~10 mg/L,溴氰菊酯对抗体-酶标半抗原反应的抑制中浓度(IC50)为1.68 mg/L,相对标准偏差(RSD,n=5)为2.11%,IC10值为0.16 mg/L。在5、1和0.2 mg/kg 3个添加水平下,DC-ELISA法测定小白菜中溴氰菊酯的平均回收率分别为97%、106%和95%,RSD(n=5)分别为8.5%、8.1%和8.1%。高效液相色谱法同步测定小白菜中添加0.2 mg/kg溴氰菊酯的回收率为107%。本研究建立的DC-ELISA法可用于小白菜中溴氰菊酯含量的快速测定。     

侵染大豆和桑的烟草坏死病毒(TNV)的鉴定

本文主要是介绍农业部植检所和有关单位共同协作进行的应用技术方面的研究结果。杀虫效果方面:室内试验得出:对谷斑皮蠹成虫、幼虫、蛹,温度11～14℃,10克/m~3,处理24～48小时,效果100%。对谷斑皮蠹卵,温度11～14℃,15～50克/m~3,处理24小时,效果9.0～62.5%,50克/m~3处理48小时,40克/m~3处理72小时效果100%,温度20～22℃,40克/m~3处理24小时,15克/m~3处理48小时也100%死亡。对谷象、玉米象、绿豆象的卵,温度20℃,15克/m~3处理48小时效果100%。对胚后期的黑皮蠹、烟草坪,印度谷蛾幼虫、玉米象、谷蠹和绿豆象成虫的效果更好。室外粮垛上试验,粮温15～16℃,50～70克/m~3处理24小时,对玉米象和绿豆象各虫态的效果100%。中草药材垛上试验,温度27～28℃,30克/m~3处理二天,对黑皮蠹幼虫、玉米象各虫态以及锯谷盗成虫效果100%。真空熏蒸,真空度负745～720mmHg,温度12～20℃,70克/m~3处理3小时,对谷象和绿豆象卵的效果方能100%。熏蒸粮食残留量测定结果:20～70克/m~3熏蒸3天,小麦中氟残留量为0.55～1.48ppm,水稻中为0.29～2.48ppm,玉米中为0.09～1.51ppm。熏蒸粉类粮食残留量高。硫酰氟熏蒸粮、棉、油、蔬菜以及林木种籽,对发芽安全。粮食在熏蒸期间对硫酰氟的吸附量,以大豆和玉米为例,分别只有溴甲烷吸附量的36%,20.3%     

香蕉花叶病的酶联免疫检测技术研究

 用分离自香蕉病株的黄瓜花叶病毒香蕉毒株(CMV-B)和烟草花叶病毒香蕉毒株(TMV-B)制备抗血清,其效价As-CMV-B为1:5000,As-TMV-B为1:8000。用这两种抗血清检测香蕉花叶病,间接ELISA和PAS-ELISA法可检测香蕉病叶汁液的最大稀释度均为1:1280,健叶汁液无非特异性反应,Dot-ELISA可检测病叶汁液的最大稀释度为1:640,健叶汁液在稀释度为1:20时有轻度非特异性反应。用间接ELISA法检测了田间香蕉病株和香蕉试管苗标样共158份,其中CMV的带毒率为58%,TMV的带毒率为19%,二者复合感染率为8.5%。     

转基因抗病毒工程烟草的田间抗性试验

方荣祥等将烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)基因转入我国烟草主栽品种NC89后,经过连续两年3代的田间选择鉴定,于1990年秋在河南获得了几个纯合的转基因抗花叶病烟草株系（待发表）。     

油菜花叶病毒15号和菸花叶病毒间干扰作用的研究

 TMV与YMV₁₅在系统感染寄主——菸(Nicotiana tabacum)上的相互干扰作用是很微弱的。同时接种二病毒时,在感染的早期(接种后2-3天) YMV₁₅占优势,在此时间以后TMV的浓度就超过YMV₁₅。二病毒以相同的侵染力同时接种心叶菸(Nicotiana glutinosa)时,则大部分的局部斑点是由YMV₁₅形成的。上述结果表明,YMV₁₅竞争侵染点的能力较TMV为大。试验并证明完整的YMV₁₅及其蛋白都能干扰TMV侵染菜豆(Phaseoluss vulgaris),因而这种干扰似决定于病毒蛋白质部分对于侵染点附着的特异性。     

从马铃薯上分离出一种脉暗病毒

 从大名红皮花皱叶植株上通过蚜虫分离出一个分离物,能侵染许多茄科植物,在直果蔓陀蘿上表现为明显的脉暗症状。
经测定致死温点为55-56℃,稀释限点为200-300倍,适宜的酸碱度为pH6-9,在22℃下体外存活期6小时,在15-25℃下经过25天的自然干燥仍保有活力。抗药力极强,能抗85%酒精、50%硫酸铜液、19%甲醛液、2.5%单宁酸,而不失其致病力。桃蚜、棉蚜、玉米蚜、麦二义蚜、麦长鬚蚜都能传播此病毒。蚜虫在病株上吸食10分钟即能带毒,带毒的蚜虫在寄主植物上放饲10分钟以上即可传染,其传毒能力与虫口密度有密切关系,每次需有10头以上才能传染。本病毒在洋酸浆、直果蔓陀蘿、龙葵等指示植物上的病状与PYV所引起的症状有显著区别,对PYV的抗血清无明显的沉淀反应,在洋酸浆上与PYV之间的交互保护作用很小。     

大豆花叶病毒病研究进展

 大豆花叶病毒病是世界性病害,导致大豆产量降低并产生种粒斑驳。目前国内外对SMV株系的划分不统一。美国报道了G1-G7,G7A,C14九个株系,日本报道了A-E 5个株系,中国东北1、2、3号株系,江苏SA-SH株系,湖北S1,S2株系,黄淮Y 1-Y7株系。各地学者开展了抗源的鉴定和抗病育种工作,筛选和选育出一批抗病品种。美国已命名3个抗性基因,Rsv1,Rsv2,Rsv3。由于抗源不同,对中国东北3个株系SM V抗性遗传研究结果不同,抗性受1对或2对显性或隐性基因控制;对江苏株系抗性遗传研究结果一致,抗性受单显性基因控制。对感染SM V后大豆植株及种粒生理生化性状的变化及抗性机制进行了研究,表明过氧化物酶同工酶等性状与抗性有关。目前已鉴定出与抗性基因连锁的SSR,RFL P和R APD分子标记,成功的克隆了SMV外壳蛋白基因并导入大豆中。     

麦类种质资源抗耐小麦黄矮病毒的田间鉴定技术研究

1983—1985年利用堆测法测定了11458份小麦、大麦和黑麦材料,其初筛淘汰率达93％以上。经统计分析,不同接虫量之间及不同生育期接虫之间差异为极显著正相关;不同生育期接虫与千粒重较对照降低的百分数之间为极显著负相关;病情指数与千粒重较对照降低的百分数之间的相关系数大于发病率与千粒重较对照降低的百分数之间的相关系数。因此,用病情指数衡量一个品种的抗耐病性、病情指数50以上为高感,50—25为感病,25以下为耐病。鉴定结果表明,我国小麦的农家品种和大麦资源中有丰富的抗源,有待开发利用;高代品系的高感性意味着可能孕育小麦黄矮病严重流行的危险性。引进国外抗源以培育新品种是一种有效途径;要注意培育抗耐小麦黄矮病毒的啤酒大麦新品种。     

接种大豆花叶病毒条件下大豆上位叶离体培养物的生长与形态发生

 本研究从接种大豆花叶病毒(SMV)江苏株系Sa、Sg的大豆植株上取上位叶为外植体,研究不同株系对愈伤组织产生及芽与根分化的影响。结果发现,愈伤组织的诱导率及其形态特点在接种与未接种间无明显差异;接种Sa的其芽分化率低于未接种的,但接种Sg的其芽分化率反略高于未接种Sg的;接种Sa、Sg后,根的发生能力减弱,但对抗病品种的影响小于感病品种。     

烟草花叶病的损失测定

对烟草花叶病损失的田间试验和统计分析结果表明:单株烟叶的产量、产值的损失率与病害级别显线性函数关系;田间的产量、产值的损失率与病株率、病情指数的关系为逻辑斯蒂模型。花叶病的发生,使受害株叶片中的蛋白质含量升高,糖含量下降,品质明显降低。     

大豆灰斑病潜育期的预测模型

 通过人工接种试验证明,在品种和小种组合一定时,大豆灰斑病的潜育期主要是由温度决定的,用有效积温可以预测潜育期的动态变化。本文供试3个品种的日显证率与有效积温的关系可以用Gompertz模型,并获得了3个品种的显症率预测式。