植物病毒编码RNA沉默抑制子的研究进展

RNA沉默是真核生物用来抵抗病毒入侵的一种普遍而又古老的防御机制，而病毒在进化过程中也相应地产生了一些与之抗衡的功能，其中编码沉默抑制子就是对抗RNA沉默的有效策略。它们分别能够在不同阶段，以不同的方式干扰来自于寄主的RNA沉默，从而有效地建立侵染。本文主要针对目前已经发现的由植物病毒编码RNA沉默抑制子的作用特征、鉴定方法以及作用副效应进行综述，并讨论了RNA沉默抑制子的研究及应用前景。     

RNA沉默机制及其介导的植物抗病毒基因工程研究进展

RNA沉默是一种由双链RNA诱导同源RNA降解的现象,是植物的一种天然抗病毒机制.但是由于长期的共进化过程,一些病毒会在siRNA沉默途径以及miRNA沉默途径中编码一些抑制蛋白来对抗这种机制,使其作用受到抑制.文章对RNA沉默的发现、过程、抑制及其由RNA沉默介导的对RNA病毒、DNA病毒的抗性、以及由转病毒基因介导的病毒抗性等几种植物抗病机制.同时,对研究中所存在的一些问题作了分析,并就今后的研究重点和方向作了展望.     

真菌RNA沉默研究进展

阻抑(Quelling)与减数分裂沉默(Meiotic silencing by unpaired DNA,MSUD)等真菌RNA沉默(RNA silencing)现象的研究拓展了我们当前对基因表达调控的认知。随着测序信息量的爆炸性增长与功能研究的不断深入,真菌RNA沉默展示出的复杂与多样为真核生物研究提供了全新的视角。本文就当前真菌RNA沉默及相关小分子RNA(Small RNA,sRNA)的研究现状做一简要概述。     

双链RNA激发的植物基因沉默及其在植物育种上的应用

在生物体内,存在大量的非编码RNA(ncRNA),小干扰RNA(siRNA)是其中一种,由双链RNA切割形成,能干扰基因表达,激发转录后的基因沉默。尽管双链RNA干扰是把基因"敲低"而不是"敲除",但它的高效和易操作性使之成为研究植物基因功能的有用工具,并通过转基因途径用于植物改良。与反义RNA技术和共抑制技术相比,RNA干扰对基因的沉默效率高,效果稳定。单基因RNA干扰就可调控多基因家族控制的农艺性状,而不必累积单基因突变。把病毒基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链结构,激发转基因植物的RNA干扰机制,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的抗性。RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白质,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险,具有较高的生物安全性。     

植物内源小RNA及其介导的基因沉默途径

阐述了植物内源小RNA的种类及其介导的多种RNA基因沉默途径,RNA沉默途径中的主要效应蛋白及复合物的组成和功能,重点介绍了miRNA介导的基因沉默途径和siRNA介导的基因沉默途径的异同及其功能,为便于了解植物基因表达调控的多层次性和复杂性,进一步挖掘和利用植物内源信号途径提供一定的参考。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制,广泛地存在于真菌、植物和动物中。主要介绍了RNAi的发现、分子机制、转基因载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用前景。     

RNA干涉及其抗病毒应用研究进展

综述RNAi的机制,植物与病毒相互作用的机制,及RNAi在植物抗病毒育种中的应用研究进展,并展望其研究前景。     

甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性

【目的】甘蔗黄叶病（yellow leaf,YL）是一种主要的甘蔗病毒病害,在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生,已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV）,属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能,为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0^Δ2-15（N端缺失15个氨基酸）和P0^Δ155-256（C端缺失102个氨基酸）,然后定向克隆到单子叶植物表达载体pUbi-nos（空载体）上,获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒RNA沉默抑制子技术,结合ImageJ软件定量分析P0及其两个缺失突变体抑制外源基因EYFP瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus,TBSV）编码的P19作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0核苷酸序列的遗传进化分析结果显示,所获得的SCYLV病毒分离物CHN-FJ4为BRA基因型,与其他BRA基因型分离物氨基酸序列一致性为96.1%-98.4%。利用MEME在线软件预测P0蛋白的保守结构域,结果表明P0蛋白含有3个显著的保守区。分别位于第1-60、76-125和161-210氨基酸残基。通过Datamonkey在线服务器（http://www.datamonkey.org）提供的5种运算方法分析P0蛋白氨基酸位点的选择压力,结果显示P0蛋白具有8个氨基酸正向选择位点。将含有P0及其缺失突变体的重组质粒连同含EYFP报告基因的pTEM12质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞,轰击后48-120 h,P0和P19逐渐地提高EYFP荧光表达点数和荧光表达水平;在120 h,与pUbi-nos空载体（不含沉默抑制子）对照组相比,P0和P19均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP荧光表达点数和荧光表达水平,分别达1.6倍和4.0倍以上。P0与P19抑制RNA沉默活性水平没有显著差异（P>0.05）。P0蛋白N端缺失15个氨基酸（P0^Δ2-15）和C端缺失102个氨基酸（P0^Δ155-256）均丧失了沉默抑制子的功能,荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP瞬时表达体系上,P0能够显著地提高外源基因EYFP表达水平。P0蛋白N端15个氨基酸和C端102个氨基酸含有显著的保守区域,是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。     

RNA沉默及其在植物基因功能研究和作物改良中的应用

RNA沉默是指导入或细胞内转录合成的双链RNA会特异性地降解具有同源序列的mRNA,从而导致内源的、外源的和病毒基因的沉默,它是真核生物特有的一种阻止转座子转座和抵御外源DNA入侵的防御机制。利用RNA沉默技术,人们正对大量基因进行功能研究,并在作物性状改良方面取得了一些可喜成果。     

植物病毒沉默抑制子P25的原核表达及纯化

通过体外DNA重组技术将P25基因连接在pET28a（＋）载体上，构建成重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及DNA序列分析，融合的P25基因序列正确。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行异丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经过亲和层析得到纯品目的蛋白P25。     

植物中RNA介导的沉默及其应用

在植物中 ,双链RNA(dsRNA)可通过降解细胞质中与之同源的mRNA而诱导产生转录后基因沉默 (PTGS) ,或通过使同源的核DNA高度甲基化而产生转录基因沉默 (TGS ,启动子甲基化 )或PTGS(转录或编码区甲基化 )。RNA介导的沉默可在细胞间进行传递 ,从而使整个植株都表现出PTGS或TGS ,且PTGS的程度会在植物发育过程中逐渐加强 ,减数分裂后重置。植物病毒也会介导产生沉默现象 ,PTGS是植物天然的一种抗病毒机制。利用导入外源dsRNA可抑制基因表达或使基因超量表达 ,使用病毒载体 ,可提供功能启动子、暂时表达系统 ,并为植物功能基因组学研究提供新的工具。     

病毒基因沉默抑制因子与AGO蛋白结合抑制RNA沉默的研究进展

总结了RNA沉默及病毒RNA沉默抑制因子(VSRs)的研究进展,以及病毒基因沉默抑制因子利用甘氨酸/色氨酸(GW)模型作为ARGONAUTE(AGO)钩和寄主发生RNA沉默的重要作用部位相互结合从而抑制基因沉默的研究机制。通过研究发现,在酵母、动植物细胞中,一些包含GW模型的蛋白质被认为是RNA沉默效应复合物中AGOs的重要协助者。结果说明,GW模型是一种能用于调节RNA沉默途径活性的万能的、有效的工具,用GW模型竞争性结合AGOs并抑制寄主基因沉默可能是一种被许多病原菌用于抵抗寄主RNA沉默的方法。     

High-Level Accumulation of Exogenous Small RNAs Not Affecting Endogenous Small RNA Biogenesis and Function in Plants

RNA silencing is a fundamental plant defence and gene control mechanism in plants that are directed by 20-24 nucleotide （nt） small interfering RNA （siRNA） and microRNA （miRNA）. Infection of plants with viral pathogens or transformation of plants with RNA interference （RNAi） constructs is usually associated with high levels of exogenous siRNAs, but it is unclear if these siRNAs interfere with endogenous small RNA pathways and hence affect plant development. Here we provide evidence that viral satellite RNA （satRNA） infection does not affect siRNA and miRNA biogenesis or plant growth despite the extremely high level of satRNA-derived siRNAs. We generated transgenic Nicotiana benthamiana plants that no longer develop the specific yellowing symptoms generally associated with infection by Cucumber mosaic virus （CMV） Y-satellite RNA （Y-Sat）. We then used these plants to show that CMV Y-Sat infection did not cause any visible phenotypic changes in comparison to uninfected plants, despite the presence of high-level Y-Sat siRNAs. Furthermore, we showed that the accumulation of hairpin RNA （hpRNA）-derived siRNAs or miRNAs, and the level of siRNA-directed transgene silencing, are not significantly affected by CMV Y-Sat infection. Taken together, our results suggest that the high levels of exogenous siRNAs associated with viral infection or RNAi-inducing transgenes do not saturate the endogenous RNA silencing machineries and have no significant impact on normal plant development.     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

RNA干涉原理及其应用

RNA干涉是指外源dsRNA引发生物体内的基因的同源序列降解，从而表现出的基因转录后的沉默现象，它与植物中的共抑制和真菌中的基因压制可能具有相同的作用机制。在这一过程中，需要eIF2c类似蛋白因子、RNA螺旋酶、RNA依赖性RNA多聚酶、核糖核酸酶、ATP和转膜蛋白参与。RNA干涉可以用于功能基因组学研究，也可用于克服转基因生物的基因沉默现象，使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达，还用于基因治疗，抑制有害基因的表达等。     

植物中依赖于RNA的RNA聚合酶研究进展

依赖于RNA的RNA聚合酶(RDR)能够以单链RNA为模版合成互补RNA链,产生双链RNA。双链RNA在细胞内被类似RNaseⅢ的酶DCL加工成20～24 nt的小分子干扰RNA(siRNA)。siRNA可以在转录水平或转录后水平抑制靶基因的表达。RDR通过基因沉默途径参与植物的生长发育调节、逆境应答以及表观遗传修饰等许多生物学过程。加深对植物RDR表达模式、生化活性及生物学功能等方面的理解将有利于植物基因沉默的发展和运用。