棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究

LC-04菌株是从棉花叶部组织中分离出的一株类芽孢杆菌,其发酵液上清液的硫酸铵沉淀物对大丽轮枝菌V-190菌株的生长具有明显的拮抗作用,实验证明发酵液中含有蛋白质类抗菌物质。LC-04菌株的适宜发酵条件为:在pH7的LBG培养基中于30℃,180 r.min-1摇床振荡培养48 h,用70%硫酸铵对LC-04菌株发酵液上清液进行盐析,可以沉淀最多的抗菌蛋白。     

河北省棉花黄萎菌落叶型和非落叶型菌系初步鉴定

利用PCR特异性扩增技术对从采自河北省的228株棉花黄萎菌(Verticillium dahliae)、四川省的2株棉花黄萎菌(菌株Sch-1和Sch-3)、辽宁省的1株黄萎菌(菌株Ly-1)、棉花黄萎菌标准菌株(落叶型标准菌株T9和非落叶型标准菌株V97)和3株棉花枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)菌株进行了落叶型和非落叶型菌系的鉴定.结果表明,利用V.dahliae特异性引物DB19/DB22从233株黄萎菌中均可获得500 bp的特异性片段,而3株棉花枯萎菌中不能获得扩增产物.分别利用非落叶型特异性引物INTNDf/INTNDr和落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r对233株黄萎菌进行PCR扩增.菌株Sch-1、Sch-3、Ly-1及非落叶型黄萎菌标准菌株V97利用非落叶型特异性引物INTNDf/INTNDr可扩增出1 100 bp的产物;采自河北省的228株黄萎菌和落叶型标准菌株T9利用落叶型特异性引物INTD2f/INTD2r可扩增出450 bp的产物.结果表明,目前河北省主要棉区棉花黄萎病菌以落叶型黄萎菌菌株为主.     

棉花黄枯萎病拮抗菌株的筛选及抗菌蛋白的分离纯化研究

从棉花植株根部筛选的108株芽孢杆菌中,通过对棉花黄枯萎主要病原菌大丽轮枝菌拮抗效果的复筛,分离到一株LC-105菌株,其抑菌圈达到20 mm以上;本研究从该菌株的发酵代谢产物中,分离出活性拮抗物质,进一步通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephacryl-S100凝胶层析对其代谢产物进行了分离纯化,证明该拮抗物质为一种蛋白质,最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了所分离物质的纯度达到电泳纯.     

一种检测棉花黄萎菌毒素致萎性的新方法-叶片针刺涂抹法

用针在棉花叶片表面0.5 cm2的面积上刺15~20个小点,然后将黄萎菌毒素溶液涂抹于针刺部位,观察记载处理部位的萎蔫程度,由此检测黄萎菌毒素对棉花致萎性的强弱。利用层析纯化的黄萎菌V991毒素对棉花的致萎性试验表明:棉苗的子叶为最佳接种部位,毒素对陆地棉感病品种鄂荆3号的致萎下限为7.3μg,接种24 h即可表现萎蔫症状。用8个不同致病力黄萎菌系的培养滤液(简称滤液)针刺涂抹3个不同抗病性陆地棉品种,同时设置相应毒素浸泡参比试验。结果表明,利用培养滤液,即可以快速、准确地检测滤液的致萎力强弱,该方法既可用于棉花品种资源对黄萎病的抗性鉴定,又可用于比较黄萎病菌的不同生理型。     

大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的棉花黄萎病,是一种危害严重的世界性病害。通过初筛和复筛得到了对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的细菌菌株12-51,通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA全序列分析,最终鉴定此菌株为Bacillus velezensis,16S rDNA序列相似度达99.74%。采用有机溶剂萃取和盐析法对发酵产物进行了提取,初步断定拮抗物质为蛋白类。通过对粗蛋白进行进一步研究发现,60%组分活性较高,并且对热以及酸碱敏感性较小。试验结果为棉花黄萎病的生物防治奠定了基础。     

棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1的分离鉴定及其防病作用

为研制和开发新疆棉花黄萎病优良生防菌剂,采用琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,分离得到一株对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)具有较强抑菌活性的拮抗菌株TUBP1。通过对形态观察、生理生化实验、16S rDNA和gyrB的基因序列分析,确定该菌株为Bacillus axarquiensis;利用生长速率法和牛津杯法分别测定了发酵液对棉花黄萎病菌抑菌活性,对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制率为78.62%±3.48%,抑菌圈直径为21.00±3.86 mm。温室盆栽试验中,TUBP1最大生防效果为43.67%,小区试验中,TUBP1最大生防效果为43.07%。     

大丽轮枝菌拮抗细菌的分离与抗菌物质鉴定

从黄萎病发病棉田未发病棉株根际土样中分离芽孢杆菌,利用对峙培养法对大丽轮枝菌进行平板拮抗实验,筛选出6株对大丽轮枝菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中3株菌发酵代谢产物具有抗菌活性。S4-3菌株发酵液滤液经100℃、30min热处理丧失抗菌活性,发酵液氯仿抽提物不具有抗菌活性,发酵液硫酸铵沉淀物有抑菌活性,但经蛋白酶处理后活性丧失,认为S4-3菌株抑菌活性物质是蛋白质。而菌株S4-5发酵液经100℃热处理后还有较高的抗菌活性,发酵液氯仿抽提物也具有抗菌活性,但硫酸铵沉淀物对病原菌无抑制作用;S5-6菌株发酵液滤液经100℃热处理丧失抗菌活性,硫酸铵沉淀物也不具有抗菌活性,而发酵液氯仿抽提物有抗菌活性,因此认为S4-5和S5-6菌株产生的抑菌物质不是蛋白质类。     

中国棉花枯、黄萎病病原菌研究

介绍我国棉花枯萎镰刀菌和黄萎轮枝菌研究进展，概述两种病原菌“种”的确定，病菌生理类型分化，致病毒素分析与致害机制。并指出加强病原菌分子生物学探索，以进一步揭示病菌造成侵害的实质。     

广谱拮抗菌B96-II的分子鉴定及GFP标记

用PCR方法扩增的广谱拮抗菌B96-II的16S rDNA经序列测定和BLAST同源序列比较,结合传统的形态观察、生理生化特征鉴定,确定了B96-II分类地位为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将含有绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因标记的大肠杆菌一枯草芽孢杆菌穿梭表达载体(pNW33N-gfp-B96-II-N)通过原生质体法转化B96-II,获得表达GFP的4株标记菌株,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.室内平板抑菌试验结果表明,GFP标记对B96-II的广谱抑菌活性没有影响.     

辣椒内生菌的分离及拮抗菌的筛选与鉴定

用稀释分离法从健康辣椒植株的茎、叶、果肉中共分离得到植物内生菌88株,其中细菌有65株,真菌有21株,放线菌2株。用平板对峙法从中筛选出内生菌003和X两株对辣椒疫霉病菌、辣椒绿霉病菌、辣椒炭疽病菌3种病原菌具有明显拮抗作用的菌株,得出抑制率为34.80%～48.0%。根据菌株形态、生理生化特性对菌株003和菌株X进行了初步鉴定,结果显示菌株003和菌株X都为芽孢杆菌属(Bacillus)。     

大丽轮枝菌拮抗细菌B.subtilis LZ2-70产芽孢条件优化

 为了提高大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）拮抗细菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis LZ2-70菌株的芽孢形成率及芽孢数量,在摇瓶发酵基础上对影响该菌芽孢形成的主要因素进行了考察。通过单因素试验确定了最佳的碳源、氮源和无机盐等,通过正交试验研究了培养基最佳浓度和组合,以及种龄、接种量、培养液初始pH和培养时间等发酵条件。摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为:0.5% 麦芽糖、2% 黄豆饼粉、0.05% KH₂PO₄和0.1% MnSO₄·H₂O、培养液初始pH值8.0、种龄24 h、装瓶量30 mL/ 250 mL 、接种量10%、发酵时间48 h、培养温度为30 ℃、摇床转速为200 r·min^-1。在此优化条件下,发酵液中LZ2-70菌株的芽孢数量达到6.6×10⁹ 个·mL^-1,芽孢形成率为98.94%。     

Physical and Chemical Properties and Antifungal Mechanism of Antifungal Protein Produced by Antagonistic Strain Bacillus subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae

The aim of this study was to investigate inhibition spectrum, characteristics and antifungal mechanism of antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 which possesses strong antagonistic abilities to Verticillium dahilae Kleb., and to offer a theoretical basis for biological control of cotton Verticillium wilt and development of transgenic resistant varieties. The inhibition spectrum of antifungal protein was studied and effects of heat, pH, proteinase, EDTA, inorganic ion on inhibiting activity were also investigated. Furthermore, cellulase and chitinase of the crude antifungal protein were determined and the inhibition to mycelium and spores was studied by different methods. Results indicated that, antagonistic protein of B. subtilis ZL2-70 against Verticillium dahilae has broad inhibition spectrum, which had strong inhibition activity to 21 different plant pathogens. It was relatively stable, could tolerate high temperature, EDTA and proteinases and keep activity in the range of pH 5-10, but it was sensitive to Fe3+. The preliminary study on inhibition mechanism demonstrated that the antifungal protein could break down the mycelium and leak the protoplasm, turn the mycelium cells into bigger sacs and inhibit germination of conidia and the inhibition activity was consistent with cellulase and chitinase activity of antifungal protein. Therefore, the inhibition mechanism is deduced as mycelial growth and spore germination are inhibited by cell enzyme activity of the antagonistic protein.     

响应面法对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7产抗菌蛋白条件的优化

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)12-7是从发病棉田土壤中分离得到的1株生防细菌,其对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.V190具有明显的拮抗作用,已证明其抗菌物质为蛋白质。采用响应面法对该生防菌株的产抗菌蛋白条件进行优化,以期为棉花黄萎病生物农药的研制开发以及抗菌蛋白的后续研究奠定基础。以发酵液上清液对大丽轮枝菌的抑菌圈面积为考察指标,首先采用单因子试验考察培养时间、温度、初始pH、碳源、氮源、无机盐等因素对菌株12-7发酵产抗菌蛋白的影响;再根据响应面分析法的基本原理和方法,对发酵条件进行优化。得出该菌株产抗菌蛋白的最优发酵培养基和培养条件为:1.5%(质量分数)蔗糖、1.5%(质量分数)大豆蛋白胨、0.3%(质量分数)NaCl、0.1%(质量分数)K2HPO4、初始p H7.3的培养基,31℃发酵培养60 h。优化后抑菌圈面积从试验设计初期的171.95 mm2提高至320.3 mm2,且经过验证试验证实预测值与实际值之间具有较好的拟合度。     

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

一株大丽轮枝菌拮抗细菌7-47菌株的分离与鉴定

 从全国各地棉田采集土样,筛选对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株。通过初筛得到具有拮抗作用的菌株68株,复筛选出1株拮抗活性较高的菌株7-47,并通过生理生化试验,形态特征的观察及16S rDNA的序列分析对其进行了鉴定,认为菌株7-47属于漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。     

棉花黄萎病拮抗细菌B.velezensis6-61拮抗蛋白发酵条件的优化

为了提高棉花黄萎病拮抗细菌B.velezensis 6-61活性物质的产量,为进一步开展6-61菌株的后续研究奠定基础,对6-61菌株产生的活性物质的性质进行了分析,并对其发酵条件进行了优化研究.采用有机溶剂萃取、硫酸铵沉淀对菌株6-61发酵液进行处理并检测抑茵活性,初步确定了该拮抗物质为蛋白质.采用单因素试验对6-6...