蜂胶佐剂对异育银鲫嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫增强试验

本文就蜂胶佐剂对鱼类细菌性疫苗的免疫增强作用进行了首次评价。试验以异育银鲫嗜水气单胞菌灭活疫苗为对象,比较了蜂胶佐剂、铝胶佐剂和无佐剂三种疫苗对银鲫的免疫效果。经抗体监测表明,免疫接种后第2周,蜂胶佐剂组银鲫已检测到血清抗体,随后抗体效价迅速上升,第4周达到峰值2^5：铝胶佐剂组和无佐剂组第3周检测到抗体．铝胶佐剂组第5周达到峰值2^5,无佐剂组第4周达到峰值2^4。银鲫免疫后第5周进行攻毒保护试验,发现蜂胶佐剂组、铝胶佐剂组和无佐剂组的免疫保护率分别为77．3％．65．0％和56．3％。试验结果表明,蜂胶佐剂能有效增强异育银鲫细菌性灭活疫苗的免疫保护力。     

不同佐剂对大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫效果

为了探究添加蜂胶佐剂、弗氏佐剂和铝胶佐剂后对大鲵（Andrias davidianus）嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）灭活疫苗的免疫效果,取已制备好的大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗,分别加入3种佐剂,充分混匀后制备成含菌量为1×108 CFU/mL的佐剂疫苗,通过腹腔注射免疫健康大鲵(平均体长40 cm、平均体质量85 g）,每尾1 mL,并设不加佐剂组和对照组;分别于免疫后第1、4、7、14、21、28、35天尾静脉采血,利用凝集反应检测血清抗体效价,于免疫后第35天进行攻毒感染试验。结果表明,与对照组相比,蜂胶佐剂组抗体效价于免疫后第1～14天呈上升趋势,第21天达最高,为1: 469.33,弗氏佐剂组于免疫后第1～28天呈上升趋势,第35天达到最大值,为1: 448.00,随后呈下降趋势;铝胶佐剂组抗体效价于免疫后第1～21天呈上升趋势,第28天达到最大值,为1: 362.67,不加佐剂组于免疫后第21天达最高,为1: 384.00,随后呈下降趋势,而对照组基本稳定在1:4.00。攻毒感染试验表明,蜂胶佐剂组、弗氏佐剂组、铝胶佐剂组和不加佐剂组的死亡率为10%、20%、25%和35%,相对免疫保护率分别为88.9%、77.8%、72.2%和61.1%,对照组大鲵死亡率为90%;3种佐剂疫苗均有较好的免疫保护效果,其中以蜂胶佐剂疫苗效果最佳。     

黄芪多糖佐剂对大菱鲆五联疫苗免疫增效作用

用福尔马林灭活哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻胶弧菌制备成五联灭活疫苗,添加黄芪多糖作为佐剂。分别用添加黄芪多糖佐剂组和无佐剂组对大菱鲆进行腹腔注射,在第7、14、21、28、35、42、56天采取血样并检测抗体效价、溶菌酶活力和SOD活力,第56天进行人工攻毒实验,测定免疫保护力。结果表明,黄芪多糖佐剂组(免疫组2)和无佐剂组(免疫组1)两组的溶菌酶活力和SOD活力都在第28天达到最高值,且黄芪多糖佐剂组显著高于无佐剂组(P<0.05)。两个免疫组抗体效价也都在第28天达到最大值,但黄芪多糖佐剂组要显著高于无佐剂组(P<0.05),其中免疫组2的哈维氏弧菌、鳗弧菌、迟钝爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和溶藻胶弧菌的抗体效价分别为27.25、26.75、28.5、28.75、26.25,免疫组1分别为26、25.75、26.75、27.5、25。用上述5种细菌分别进行人工攻毒实验,结果表明,免疫组2的免疫保护力依次为50.0%、50.0%、71.4%、62.5%、44.4%;免疫组1的免疫保护力依次为37.5%、30.0%、42.9%、50.0%、33.3%。实验结果证明,五联疫苗对大菱鲆具有免疫作用,而且添加黄芪多糖佐剂组的免疫效果显著好于无佐剂组。     

山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果

为研究山莨菪碱作为佐剂在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的作用,将山莨菪碱和嗜水气单胞菌全菌灭活疫苗联合浸泡免疫异育银鲫,首次浸泡免疫7d后加强免疫1次.通过实时荧光定量PCR检测第2、4、7、11、14和21天脾脏中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶的mRNA表达量,并在第21天进行同源菌株活菌攻击实验.结果显示,山莨菪碱组第4天IgM和IL-1 β的表达量达到最高值,分别为28.3和332.7;而无佐剂疫苗组第11天IgM和IL-1β达到最高值,分别为56.1和791.8.山莨菪碱组的补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的表达量都显著高于无佐剂组和对照组,且表达持续时间长.活菌攻击实验表明山莨菪碱组的相对免疫保护率可达80.0％,显著高于无佐剂组的56.0％.结果表明,山莨菪碱与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫银鲫,可以增强脾脏中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高银鲫相对免疫保护率.     

肠型点状气单胞菌和鱼害粘球菌的融合子特性研究

为了探索病原菌融合疫苗制备的可行性及其理论基础，查明鱼类病原菌融合子的遗传规律，本研究对草鱼肠炎病和烂鳃病病原的融合子特性进行了研究，结果表明：筛选的融合子菌株菌体大小、酶类性状及生理生化指标介于两亲本菌株之间；融合子菌株具有致病性，用融合菌株制成灭活抗原进行抗原性研究，免疫保护率达74．9％和75．5％，抗体效价于第4周达到峰值，分别为1：322．5和1：435．5。     

灿烂弧菌灭活菌苗对美国红鱼免疫效果的研究

制备灿烂弧菌(Vibrio splendidus)福尔马林灭活菌苗,通过浸泡、注射和口服3种方式接种美国红鱼(Sci-aenops ocellatus),分别在接种免疫后第7、14、21、28、35天采鱼血,检测其血清抗体效价、溶菌酶活力和白细胞吞噬活性;第28天用1.0×108CFU/mL的灿烂弧菌悬液进行攻毒试验,检测菌苗的免疫效果。结果表明,各免疫组血清抗体效价在第21天达到峰值,且浸泡组和注射组的血清抗体效价高于口服组;在35d实验期内,各免疫组的血清溶菌酶活力有明显提高,各浸泡组和注射组于免疫接种后14d显著高于对照组(P<0.05);除浸泡3组外,其余各免疫组的白细胞吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)在免疫接种后14d均较对照组有显著差异(P<0.05);各组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用,以注射2组的免疫保护率最高,达77.8%。     

灿烂弧菌灭活菌苗对美国红鱼免疫效果的研究

制备灿烂弧菌(Vibrio splendidus)福尔马林灭活菌苗,通过浸泡、注射和口服 3种方式接种美国红鱼(Sciaenops ocellatus),分别在接种免疫后第7、14、21、28、35天采鱼血,检测其血清抗体效价、溶菌酶活力和白细胞吞噬活性;第28天用1.0×108CFU/mL的灿烂弧菌悬液进行攻毒试验,检测菌苗的免疫效果.结果表明,各免疫组血清抗体效价在第21天达到峰值,且浸泡组和注射组的血清抗体效价高于口服组;在35 d实验期内,各免疫组的血清溶菌酶活力有明显提高,各浸泡组和注射组于免疫接种后14 d显著高于对照组(P<0.05);除浸泡3组外,其余各免疫组的白细胞吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI)在免疫接种后14 d均较对照组有显著差异(P<0.05);各组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用,以注射2组的免疫保护率最高,达77.8%.     

嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后的免疫应答反应与保护效果

为了研究嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt,1869)后的免疫应答反应与保护效果,本研究采用福尔马林灭活法制备嗜水气单胞菌灭活疫苗。通过腹腔注射途径免疫健康施氏鲟,对施氏鲟外周血的红细胞和白细胞数量、白细胞组成、吞噬活性、吞噬指数、血清酸性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清中和抗体效价等免疫指标及疫苗保护效果进行测定。结果显示,免疫组红、白细胞数量迅速上升,于免疫后第4天达峰值,分别为(8.50±0.17)×10~8个/mL和(8.96±0.44)×10~6个/mL;单核细胞和嗜中性粒细胞分类百分比于第7天达峰值,分别为10.50%和15.53%,极显著高于对照组(P0.01),淋巴细胞分类百分比在第21天才达峰值73.51%;吞噬指数和吞噬百分比均于第4天达到最高值,分别为4.53和30%;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性分别在免疫后第7天和第14天达到峰值,极显著高于对照组(P0.01);血清抗体效价于免疫后第21天达到峰值1:203,极显著高于对照组(P0.01)。攻毒感染实验结果表明,免疫组的相对免疫保护率为76.84%。由此可见,嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后,能够显著诱导施氏鲟体内的免疫应答反应,增强鱼体的免疫保护能力。本研究为养殖鲟因嗜水气单胞菌感染引起疾病的免疫预防技术研究奠定了前期基础。     

鳜浸泡嗜水气单胞菌全菌疫苗后皮肤黏液抗体的变化

应用间接ELISA方法,研究经嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)疫苗浸泡免疫后鳜(Siniperca chuatsi)皮肤黏液中抗体消长规律,以揭示鳜局部黏膜免疫在免疫保护中的作用及浸泡免疫的保护效果。结果表明,鳜皮肤黏液中抗体滴度在免疫后第7天达到峰值211,抗体从开始形成到消失持续21 d;添加佐剂(IMS1312、葡聚糖、莨菪碱、食盐)可以提高鳜皮肤黏液及血清中抗体滴度和相对免疫保护率,其中添加IMS1312组免疫保护率最高,达77.8%,免疫保护与抗体滴度成正相关(R2=0.79,P<0.05);以溶菌酶为代表的非特异性免疫在免疫后1周内即抗体未形成时,对鱼体起主要保护作用。此外,通过比较鳜血清与皮肤黏液中的抗体消长规律,发现血清中抗体滴度峰值出现时间较迟(第14天),抗体持续时间较长(42 d),初步推断鳜皮肤黏膜中可能存在相对独立于全身免疫系统的局部黏膜免疫系统。     

草鱼多联佐剂疫苗的研究

本研究应用ANAE染色法检测了免疫草鱼外周血淋巴细胞，阳性率结果表明：草鱼在免疫后的第一天淋巴细胞的阳性率明显升高，至第180天时仍远远超过正常草鱼的阳性率；细胞免疫在草鱼的免疫中具有重要作用，从而揭示了多联佐剂疫苗之所以具有显著抗病力的免疫机制。这一结果为国内首次报道。     

嗜水气单胞菌重组β-hemA-ISCOMs对鳗鲡的浸泡免疫效果

嗜水气单胞菌重组β-hemA-ISCOMs对鳗鲡的浸泡免疫效果=Immune effects of the eel after immersed with ISCOMs containing recombinant β-hemA of Aeromonas hydrophila[刊，中]/吴宗福(福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003)，龚晖，陈红燕，杨金先，刘晓东，林天龙//水产学报，－2007，31（3），－374～378 应用嗜水气单胞菌β-hemA重组菌表达产物作为抗原，制备成免疫刺激复合物（β-hemA-ISCOMs），通过浸泡途径免疫鳗鲡，测定免疫鱼细胞和抗体应答水平和免疫效力。试验结果表明：（1）β-hemA-ISCOMs在电镜下呈笼格状颗粒，直径约40 nm；（2）一免后第44天，β-hemA-ISCOMs免疫组淋巴细胞转化率显著高于非β-hemA-ISCOMs免疫组（P<0.05）；（3）免疫浓度在30～120 mg•L-1时，β-hemA-ISCOMs免疫组血清抗体效价与浓度正相关，且显著高于ISM1312佐剂组与无佐剂组（P<0.05）；（4）免疫浓度在30～120 mg•L-1时，β-hemA-ISCOMs免疫组存活率与免疫接种剂量正相关，在同等剂量下，β-hemA-ISCOMs免疫组的存活率高于其它组。因此β-hemA-ISCOMs浸泡免疫可诱导宿主产生细胞与抗体介导的免疫应答，产生保护性免疫，ISCOMs技术适用于制备浸泡型渔用疫苗。图3表4参13     

多联佐剂疫苗免疫机制的探讨

应用ANAE染色法检测了免疫草鱼外周血淋巴细胞，阳性率结果表明：草鱼在免疫后的第一天淋巴细胞的阳性率明显升高，至第180天时仍远远超过正常草鱼的阳性率。细胞免疫在草鱼的免疫中具有重要作用。从而揭示了多联佐剂疫苗之所以具有显著抗病力的免疫机制。这一结果为国内首次报道。     

约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜免疫效果评价

为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和抗体效价变化规律。结果表明,约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫后,鳜肝脏Lys基因表达量显著上调(P0.05),第48小时表达量达到峰值,是对照组的10.9倍(P0.05),直到第28天表达量仍显著高于对照组(P0.05)。同时免疫鱼血清Lys活性明显升高,第2天达到峰值,是对照组的4.35倍(P0.05),第6天与对照组水平相当;免疫鳜脾脏Ig M基因相对表达量从第7天开始上调并显著高于对照组(P0.05),至第28天其相对表达量为对照组的98.7倍(P0.05);而免疫鱼血清抗体效价在第7天开始高于对照组,第28天达到峰值(26)。免疫后第28天采用强毒株M168进行攻毒,结果显示,免疫组相对成活率显著高于对照组,其相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS)达85.9%。结果表明约氏黄杆菌减毒株M170可引起鳜特异性和非特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护效果。     

鰤诺卡氏菌灭活疫苗对大口黑鲈非特异性免疫指标的影响

研究大口黑鲈(Micropterus salmoides)对鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)灭活疫苗非特异性免疫应答的变化过程,为预防鰤诺卡氏菌病提供理论依据,可促进养殖业健康发展。大口黑鲈平均体长(10±2)cm、平均体重(30±2)g,鰤诺卡氏菌从患病大口黑鲈身上分离鉴定获得。600尾大口黑鲈随机分为免疫组和对照组,每组300尾,免疫组通过腹腔注射菌浓度为1.0×10⁹CFU/mL的鰤诺卡氏菌灭活疫苗0.5 mL/尾,对照组注射同等剂量的磷酸盐缓冲液。免疫后的第1、7、14、21、28和35天采集血液样品,测定血细胞数量、吞噬细胞吞噬活性、溶菌酶活力、酸性磷酸酶活力以及超氧化物歧化酶活力等非特异性指标。免疫接种第35天后进行攻毒试验,计算相对免疫保护率。结果表明：免疫组血细胞数量显著增加,红细胞和白细胞数量均于第7天达峰值,分别为(4.49±0.23)×10⁶个/mm³和(3.88±0.24)×10³个/mm³;免疫组吞噬指数和吞噬百分比均在第7天达到最高值...     

鸡抗鸭源大肠杆菌卵黄抗体的研制

用鸭源大肠杆菌125号菌株制成的灭活油佐剂苗、蜂胶苗及无佐剂菌苗作为免疫原,免疫经产蛋鸡,定期收集鸡蛋,用氯仿提取卵黄抗体,采用试管凝集法检测抗体效价。结果表明:油佐剂灭活苗的抗体维持时间较长,在免疫后60d还能保持较高水平,其峰值达到1∶24。蜂胶灭活疫苗的抗体产生速度比较快,消失也较快,其峰值达到1∶12,40d后抗体基本上消失。不加佐剂的灭活菌苗抗体产生速度较快,10d达到峰值1∶16,然后呈逐渐下降趋势,免疫40d后波动较小。结果,油佐剂灭活菌苗免疫后产生的抗体效价及持续时间高于无佐剂灭活苗和蜂胶苗的抗体效价。     

重组多子小瓜虫抑动抗原ISCOMs制备

提取表达于四膜虫(Tetrahymena thermophila)细胞膜表面的多子小瓜虫抑动抗原.通过Western Blotting证实重组多子小瓜虫抑动抗原约为35.7 kD,其免疫原性与多子小瓜虫抑动抗原相似.以Quil-A作为佐剂,采用离心、超声波和透析等方法制备小瓜虫抑动抗原免疫刺激复合物(Iag-ISCOMs).电镜观察可见Iag-ISCOMs经磷钨酸负染后呈直径30～40 nm的笼格状结构.免疫和攻毒试验证实Iag-ISCOMs对鳗鲡具有一定保护能力,攻毒后存活率达71.4％,对照组存活率为43.9％,结果表明,本实验成功制备了具有一定免疫原性的Iag-ISCOMs.     

银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答研究

以绵羊红细胞为载体,建立了检测银鲫血清抗体的间接血球凝集试验。用该方法研究了银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答一般规律。研究结果表明,疫苗免疫组在免疫７天后可以测到血凝抗体,２１天达到高峰值４０９６,然后开始下降,３５天时抗体滴度降为１６。加弗氏不完全佐剂疫苗免疫组亦在７天时可以测到血凝抗体,２１天达到１０２４,３５天时为２０４８,抗体维持在较高的水平。对鱼体免疫后的保护力进行测定,结果表明,两个免疫组分别在７天左右和１４天左右开始产生保护力。免疫保护力在鱼体免疫初期随着抗体滴度的增加而加强,随后在一段时间内保持在较强的水平,并不随抗体滴度的下降而减弱。浸泡免疫试验的结果亦表明,银鲫可以通过浸泡免疫获得免疫保护力。     

水库暴发性鱼病及其防治技术研究

用经酚灭活的嗜水气单胞菌和由该菌提取的脂多糖作为抗原对鱼进行注射免疫后，其血清中凝集抗体效价在第４周达到峰值，血液和头贤中吞噬细胞活性均高于对照鱼，以活菌攻毒后鱼体免疫保护力分到达５３．９％和６９．２％。     

草鱼对CFRV疫苗免疫应答的研究

本文研究了草鱼对ＣＦＲＶ疫苗的免疫应答水平，规律性，免疫效应期及免疫持久性。用该疫苗免疫后的草鱼能产生很强的应答反应，免疫保护力可达８０％以上，血清中和抗体效价非常明显地高于对照组。它的免疫效应期在５天以内，第１０天血清中和抗体达到较高水平，第２０天处于峰值，并可维持２０余天，以后在第１０天的水平上波动。草鱼对ＣＦＲＶ疫苗的免疫持久性在１３个月以上。     

一种佐剂新材料在嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫中的应用效果

为研究蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷(CPMG)在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的佐剂作用,将CPMG和嗜水气单胞菌灭活疫苗联合施用,二次浸泡免疫异育银鲫后饲养在室内玻璃缸中,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测加强免疫后2、4、7、11、14和21 d脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素和溶菌酶的m RNA表达量,首次免疫30 d后用同源菌株活菌攻击实验鱼;同时,用含CPMG、山莨菪碱复合佐剂的灭活疫苗浸泡免疫异育银鲫一次后饲养在池塘网箱中,定期抽取血液检测血清抗体效价并用同源菌株人工感染实验鱼。结果显示,CPMG佐剂组和无佐剂组的5个免疫相关基因的相对表达量显著高于对照组,CPMG组Ig M基因较无佐剂组更早表达,补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的基因表达量更高或表达持续时间更长。血清抗体效价在免疫后2周达到160,6周达到峰值640,12周降低为40。室内玻璃缸中二次免疫30 d后,CPMG组的平均相对保护率达到70.6%,复合佐剂组达到88.2%,均显著高于无佐剂组的56.0%。池塘网箱中一次浸泡免疫30、60和120 d后,平均相对保护率分别为54.6%、44.0%和12.5%。研究表明,CPMG与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫异育银鲫,增强了脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高了异育银鲫抗嗜水气单胞菌感染的能力。