H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达及其单因子血清的制备

为了制备特异性识别H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的单因子血清,本试验提取H9N2亚型AIV RNA,RT-PCR后,分别扩增上段HA1、中段HA2和下段HA33段基因。将他们插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达的蛋白常规免疫昆明白小鼠,以制备抗血清。结果显示,成功获得3段重组融合蛋白,且均具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,上段HA1、中段HA2制备的单因子血清均可与H9N2亚型AIV反应,而下段HA3则不能。重组马立克氏病病毒(MDV)MZC12 HA/NA同样证明HA1、HA2两段制备的单因子血清能识别HA基因的表达。本试验成功制备了识别H9N2亚型AIV HA的单因子血清,为H9N2亚型AIV的鉴别诊断及研究奠定了基础。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒（AIV）的HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达，其产物具有抗原性；且不与H7、H9AIV的抗血清发生交叉反应，具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示，表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用，同样具有良好的抗原性。试验结果证明，表达的H5亚型AIV的HA1蛋白，为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。     

H6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析

为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。     

1株野鸟源H7N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠感染性研究

旨在对2021年分离自我国宁夏回族自治区野鸟粪便中的1株低致病性H7N3禽流感病毒(AIV)A/mallard/Ningxia/Y37/2021(H7N3)株进行了全基因组测序、遗传进化分析及对小鼠致病性试验。全基因组序列分析表明，HA基因裂解位点仅有1个碱性氨基酸，符合低致病性AIV的分子特性。遗传进化分析结果表明，HA基因和韩国野鸭源H7N7亚型AIV同源性较高；NA基因与韩国野鸟源H5N3亚型AIV同源性较高；PB2、PA基因与H5N2亚型AIV有较高的同源性；PB1基因与H5N3亚型AIV有较高的同源性；NP基因与H3N2亚型有较高同源性；M、NS基因与H3N8亚型有较高同源性，具有明显的遗传多样性。血凝抑制(HI)试验结果表明，该毒株与H7N9-Re4疫苗株抗血清的HI效价比同源毒株低16倍，抗原性差异显著。小鼠感染性试验结果显示，该病毒能在小鼠的肺部与鼻甲中复制，并引起感染小鼠体重下降，表明该毒株有感染哺乳动物的风险。本试验通过对1株野鸟源H7N3亚型AIV部分生物学特性的分析，为H7N3亚型禽流感的预警和综合防控提供重要理论参考。     

H4亚型和N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简单、快速鉴别H4亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的保守区域,分别设计筛选出1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型和N2亚型AIV二重RT-PCR检测方法。该法可特异性扩增H4亚型和N2亚型AIV,对其他亚型AIV和常见禽病病原体无交叉反应;对H4亚型和N2亚型AIV的检测下限均为10~4拷贝/μL;对152份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的二重RT-PCR方法为H4亚型和N2亚型AIV的诊断提供了快速、特异、敏感和有效的检测方法。     

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV (简称H7N9AIV) mRNA疫苗，本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021 (H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR)，构建了中间转录质粒p GEM-YN和p XT7-YN，以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA m H7-YN-p GEM和m H7-YN-p XT7；将2种mRNA转染HEK293T细胞，western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带；通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达，结果显示，3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强；将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明，本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的m...     

青海湖一株野鸟源H5N1亚型禽流感病毒核酸检测及其基因组序列特性分析

2022年8月,青海省刚察县野鸭出现异常死亡。采集死亡野鸭的组织提取核酸,经禽流感病毒(AIV)M基因引物初步鉴定定样品中含有AIV,随后H5/H7/H9分型引物鉴定。进一步二代测序后获得了AIV的8片段基因序列。序列比对分析表明,除了NS基因,其余基因与以往报道或H5亚型AIV标准毒株的内部基因同源性较高,HA基因裂解位点具有高致病性(HPAI)AIV的特征,故将感染野鸭的毒株命名为A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)。从HA基因的遗传进化分析中发现,A/Wigeon/Qinghai/2022(H5N1)与最近几年在野鸟中流行的H5N1和H5N8同在2.3.4.4b分支,而与2005—2015年在青海湖地区流行的毒株遗传距离较远,表明青海湖野鸟源H5亚型AIV遗传多样性丰富,需要持续对该地区野鸟中携带的AIV进行监测。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因，将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞，经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒，用其感染Sf9昆虫细胞，并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明，表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

H7亚型和N9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种H7亚型和N9亚型禽流感病毒(AIV)可视化快速检测方法。根据GenBank中H7亚型和N9亚型AIV HA和NA基因序列,在其保守区域设计筛选出H7亚型和N9亚型AIV的特异性LAMP引物各一套,优化反应条件,建立能检测H7亚型和N9亚型AIV RT-LAMP方法,并进行特异性和敏感性检验。结果显示,该法用实时浊度仪63℃反应1h,能特异性地检测H7亚型和N9亚型AIV,而对其他15个H亚型和8个N亚型的AIV和禽类呼吸道病原体均无扩增,最低能检出10拷贝·μL-1目的基因。所建立的H7亚型和N9亚型RT-LAMP方法特异性强、敏感性高,结果可视化,操作简便、快速,为H7、N9和H7N9亚型AIV的有效防控提供技术支撑,具有较好的应用前景。     

广州市活禽市场7株H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解广州市活禽交易市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异特点和流行情况,本研究对2015年5月~2016年6月分离的7株H9N2亚型AIV进行全基因组的遗传进化分析。结果显示,7株H9N2亚型AIV均属于G57基因型,其中有4株分离株的部分内部基因与人源H7N9亚型病毒株基因的核苷酸同源性在99%以上。HA裂解位点未发现碱性氨基酸的替换,HA潜在糖基化位点存在添加或缺失现象,HA蛋白aa155位和aa226位分别为苏氨酸(T)和亮氨酸(L),具有结合人流感病毒受体能力。NA蛋白颈部存在氨基酸缺失,M1蛋白N~(30)D、T~(139)A、T~(215)A,NS1蛋白P~(42)S等突变可能会增加病毒的致病性。结果表明广州市活禽交易市场H9N2亚型AIV的基因型趋于稳定,但其糖基化位点和受体结合位点等呈现多样化,并且H9N2亚型AIV的内部基因能够为其它亚型AIV提供内部片段,其对养殖行业及人类健康产生潜在威胁,仍需对其进行持续的监测。     

H9亚型禽流感病毒HA1基因的克隆表达及其生物学活性的初步分析

根据GenBank已发表序列设计引物，通过RT-PCR成功获得了H9亚型禽流感病毒北京分离株A／Chicken／Beijing／1／96（H9N2）的HA1片段，经序列分析HA1片段与其他已发表序列同源性为95％～98％。将HA1片段克隆入pET．28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-H9HA1并转化宿主菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实，H9HA1片段得到表达，并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的HA1蛋白不具备血凝活性，其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒H9亚型单特异性血清反应，而与禽流感病毒H5、H7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性，有开发成为H9亚型禽流感检测试剂的可能。     

H6N1亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H6、N1亚型禽流感病毒(AIV)HA、NA基因,分别设计并筛选出2对特异性引物,用于H6亚型AIV和N1亚型AIV的检测,优化反应条件,建立了H6N1亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。对该法进行特异性、敏感性检验,并用该法对临床样品进行检测。所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447 bp(H6亚型)和325 bp(N1亚型)目的条带,对H6Ny亚型AIV仅扩增出447 bp目的条带,对HXN1亚型AIV仅扩增出325 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带;该法对H6N1亚型AIV检测下限为5×102拷贝/μL;341份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。本研究所建立的H6N1亚型AIV RT-PCR特异性强、灵敏度高,一管可同时检测H6和N1亚型AIV,为H6N1亚型AIV的检测提供一种简便、快速和有效的检测方法。     

泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用

为研究Cbl蛋白(Casitas b-lineage lymphoma)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NS)基因水平;采用RNAi技术检测Cbl对病毒HA基因表达水平的影响。结果显示:EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及测序分析发现,成功构建真核表达重组载体FLAG-Cbl; Western blot结果证实H9N2亚型AIV感染FLAG-Cbl重组载体转染的A549细胞6 h时,病毒NP蛋白表达降低;荧光定量PCR结果证实病毒NP、NS及HA基因在AIV感染FLAG-cbl重组载体转染的A549细胞的6和12 h时表达水平均明显降低;RNAi敲低A549细胞内源性Cbl蛋白后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12、24和36 h明显升高。结果表明:Cbl蛋白能在早期抑制H9N2亚型AIV在A549细胞上的复制,为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗AIV的药物研发提供了参考。     

H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速、简便检测H3N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,根据H3和N2亚型AIV HA、NA基因保守序列,分别设计筛选了特异性引物和用不同荧光基团标记的TaqMan探针。通过优化反应条件,建立了H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示该法特异性强,不与其他亚型AIV和常见禽病病原体发生交叉反应,敏感性达100拷贝/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于3%;应用该法对96份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。表明本研究建立的H3N2亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于H3N2亚型AIV的快速诊断和监测。     

禽流感病毒单克隆抗体的研制及初步应用

接种H5N1亚型禽流感病毒(AIV)鸡胚尿囊液，经甲醛灭活后，差速离心提纯病毒，三次免疫BALB／c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓细胞SP2／0-Ag-14融合。用间接ELISA和血凝抑制(HI)试验筛选阳性杂交瘤细胞株。本研究共获14株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株，其中McAb A6具有HI特性，并可以与重组鸡痘病毒表达的H5亚型AIV HA蛋白反应。用间接EHSA试验测定McAbs与125株AIV分离株的反应性。用反应谱广的McAbs(483和F2)进行交叉反应实验，确定了McAbs可用于夹心ELISA的最佳包被和酶标方式。以McAb483为基础建立的夹心ELISA对175株各亚型的AIV的阳性检出率在90％以上。     

表达分泌型与膜结合型HH7N9 AIV血凝素蛋白重组NDV载体疫苗的免疫原性比较

研究以新城疫病毒(NDV)弱毒株LX为载体,构建了一株表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)血凝素(HA)胞外区的重组病毒(LXs HA),并与一株前期构建的表达膜结合型HA的重组病毒(LXHAF)进行比较。生物学特性评价显示,两株病毒均为弱毒且在鸡胚中的繁殖性能较强。此外,LXs HA主要以分泌形式表达HA蛋白,而LXHAF则以膜结合形式表达HA。鸡的免疫试验显示,两株重组病毒在一次免疫后均能诱导针对NDV载体的血凝抑制抗体,但LXHAF能够诱导较高水平的H7N9 AIV特异性Ig Y抗体,而LXs HA不能诱导H7N9 AIV抗体应答。结果表明,表达膜结合型HA的重组病毒具有针对H7N9 AIV较好的免疫原性,而表达分泌型HA的重组病毒免疫原性较差。这为研发H7N9亚型禽流感载体疫苗提供新的信息与参考。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组杆状病毒疫苗候选株的构建与免疫效果评估

为了有效防控H7N9亚型禽流感疫情,研制能够预防高致病性H7N9亚型禽流感的疫苗非常必要。研究基于昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS),构建并拯救了一株表达高致病性H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的重组杆状病毒rBac-GD15HA。间接免疫荧光试验及免疫印迹试验鉴定结果表明rBac-GD15HA的HA蛋白在Sf9细胞中成功表达;重组病毒细胞传代试验结果表明rBac-GD15HA在传代过程中能保持较高的病毒滴度,且遗传稳定;鸡的免疫试验结果显示,重组疫苗在一次免疫后即能诱导较高水平的针对H7N9 AIV的抗体应答,并能提供针对高致病性H7N9 AIV 100%的临床保护。因此,研究结果可作为H7N9亚型禽流感疫苗研发策略的参考,为其防控提供一种安全有效的方法,也为今后广谱流感疫苗的研发奠定一定的基础。