抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的研究——禽脑脊髓炎病毒抗原的培养和纯化

为获得用于制备AEV单克隆抗体的抗原，将禽脑脊髓炎病毒（AEV VR）接种于鸡胚成纤维细胞（CEF）盲传，通过间接免疫荧光试验（IFA）监测AEV增殖情况，以第六代CEF培养物作为种毒扩大培养，将其培养物经差速率心后的半提纯物接种6日龄SPF鸡胚、1日龄SPF鸡，再将半提纯物经密度梯度离心后进行PAGE－SDS电泳，电镜观察。结果证实，AEV VR在CEF上增殖成功。     

禽脑脊髓炎病毒XY13株的分离鉴定及遗传进化分析

采集患病雏鸡脑组织样品制成组织悬液进行SPF鸡胚传代,通过免疫组化试验、动物试验、RT-PCR扩增VP1基因片段对病原进行鉴定,并对基因序列进行遗传进化分析,结果分离了1株禽脑脊髓炎病毒(AEV),命名为XY13株。免疫组化结果显示脑组织切片中存在大量的深棕黄色着色区域;动物试验中雏鸡出现了震颤、共济失调等禽脑脊髓炎(AE)临床症状,剖检发现脑组织软化、有散在出血点;RT-PCR扩增出的目的片段长度为288bp,编码96个氨基酸;序列分析表明AEV XY13株分离株与参考毒株的核苷酸同源性为74.6%~99.7%,氨基酸同源性为76.0%~97.9%;进化树分析表明AEV XY13与SX株的处于相同的分支,与1143、YL、L2Z株同处于一个较大的分支上,而与VanReokel、NH-937和204C株则处于不同的分支上,表明亲缘关系较远;进化距离预测结果表明AEV XY13株与1143、L2Z、SX和YL株的进化距离均小于0.011,而与NH-937、Van Reokel和204C株的进化距离则大于0.060。结果表明:本分离株为AEV,与目前已知的AEV毒株在进化关系上存在一定的差异。     

用改进的方法提纯禽脑脊髓炎病毒

将AEV VR株种毒经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚复壮,然后取复壮的病毒作为种毒经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚扩大培养病毒,继续孵化至18日龄,收取病变明显的鸡胚脑组织、胰腺和小肠,充分研磨后经差速离心和CsC l密度梯度离心提纯AEV,取经密度梯度离心后的样品进行电镜观察其纯度,并经脑内接种1日龄SPF雏鸡观察其致病情况及其病理变化,结果证明获得了纯化的AEV。     

禽脑脊髓炎病毒内蒙株(AEV-NH937)病毒含量检测和感染鸡胚病理变化的研究

禽脑脊髓炎（Avian Encephalomyelitis,AE）又称流行性震颤,是由禽脑脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitis Virus,AEV）引起的主侵幼禽的一种病毒性传染病。自1980年以来,我国许多省区,包括内蒙地区均有发生本病的报道,AE给养禽业造成了极大的损失。经鉴定AEV—NH937病毒株,是一株在内蒙古毒力较强的AEV毒株。现将本次试验中AEV—NH937株第8代株毒力测定过程及接毒鸡胚感染后病理变化观察结果总结如下：     

禽脑脊髓炎病毒的提纯和电镜观察

将禽脑脊髓炎病毒ＶａｎＲｏｅｋｅｌ株、１１４３株和Ｎ９３７分别经卵黄囊接种于６日龄ＳＰＦ鸡胚，接毒１０日后解剖鸡胚，收集尿囊液，采集脑，消化道和胰腺，用玻璃匀浆器制备２０％的组织悬液。     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒Van Roekel(AEV VR)株通过SPF鸡胚传代复壮，获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒1143(AEV 1143)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VPl基因序列，设计了3对引物，分别扩增AEV VR株的VP0、VP3、VP1基因，将RT-PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明，AEVVR株与AEV1143株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为95．1％、93．6％和93．9％；氨基酸的同源性分别为97．57／6、97．5％和99．6％。     

AE油佐剂灭活疫苗对鸡胚和仔鸡的保护力试验

三批禽脑脊髓炎(AE)油佐剂灭活疫苗免疫开产前种鸡,种鸡免疫2~3个月后所产种蛋对禽脑脊髓炎病毒(AEV)鸡胚易感性试验的受保护率达100%,而同期所产种蛋孵出的仔代雏鸡,在出雏后3周内对AEV VR株攻毒的受保护率亦达100%; 种鸡免疫6~7个月后所产种蛋对AEV VR鸡胚易感性试验的受保护率达75%~80%,而同期所产种蛋孵出的仔代雏鸡,在出雏后3周内对AEVVR株攻毒的受保护率达70%~90%。试验结果表明,AE灭活疫苗AEV鸡胚易感性试验的鸡胚保护率与同期雏鸡对AEV VR肌肉途径攻毒的保护率基本相同。     

利用鸡胚成纤维细胞培养禽脑脊髓炎病毒的研究

利用鸡胚成纤维细胞 (CEF)培养禽脑脊髓炎病毒 (AEV) ,经过六次盲传发现 :AEV在 CEF上无细胞病变 (CPE) ,但利用 CEF细胞上清接种 SPF鸡胚 ,可产生不同程度的 AE鸡胚病变。分别取不同时间的感染细胞上清 ,测定 AEV浓度 ,结合培养条件 ,进而确定 AEV培养的最佳时机。结果表明 :以 AEV在 CEF上培养 7天最好 ,病毒滴度可达 10 2 .8EID50 / 0 .2 ml。将经 CEF培养的 AEV差速离心 (浓缩约 5 0 0倍 ) ,接种 SPF鸡胚 ,可产生典型的鸡胚病变 ,其滴度为 8× 10 5.0 EID50 / 0 .2 m l。通过 Cs Cl密度梯度离心提纯病毒 ,在电镜下观察到了大小基本一致的病毒粒子 ,病毒直径约为 2 5 nm。利用 AEV感染的 CEF或通过“细胞飞片”制备荧光片 ,建立了间接免疫荧光快速检验 CEF是否感染 AEV的方法。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得2株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。运用建立的IFA对单抗进行了初步运用,在外源病毒检测方面与经典方法符合率高。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒（AEV）Van Roekel株作为免疫原，免疫6周龄BALB／c小鼠，采取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选，间接免疫荧光法（IFA）和免疫组织化学法鉴定，经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2，制备了腹水，并利用该单克隆抗体初步建立了Dot—ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

警惕产蛋鸡脑脊髓炎的流行

禽脑脊髓炎（AE）又称流行性震颤,病原为禽脑脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus,AEV）,属微RNA病毒目（Picornavirales）微RNA病毒科（Picornaviridae）震颤病毒属（Tremovirus）成员。     

AE油佐剂灭活疫苗对鸡胚和仔鸡的保护力试验

三批禽脑脊髓炎(AE)油佐剂灭活疫苗免疫开产前种鸡,种鸡免疫2～3个月后所产种蛋对禽脑脊髓炎病毒(AEV)鸡胚易感性试验的受保护率达100%,而同期所产种蛋孵出的仔代雏鸡,在出雏后3周内对AEVVR株攻毒的受保护率亦达100%;种鸡免疫6～7个月后所产种蛋对AEVVR鸡胚易感性试验的受保护率达75%～80%,而同期所产种蛋孵出的仔代雏鸡,在出雏后3周内对AEVVR株攻毒的受保护率达70%～90%。试验结果表明,AE灭活疫苗对AEV鸡胚易感性试验的鸡胚保护率与同期雏鸡对AEVVR肌肉途径攻毒的保护率基本相同。     

60Coγ射线对高免卵黄液中AE病毒的灭活

用不同剂量、剂量率的^60Coγ射线，对人工污染一定量的禽传染性脑脊髓炎病毒（AEV）的高免卵黄液进行辐照，研究了其对病毒的灭活效果和对卵黄抗体的影响。结果表明，^60Coγ射线辐照，可以灭活高卵黄液中的AEV，且随辐照剂量、剂量率的增大，灭活率也增高；AEV在卵黄液中的D10值为6.61-7.06kGy;9.2kGy以上的辐照剂量，可以将高免卵黄液中的AEV完全灭活，且不影响抗体效价。     

商品蛋鸡要严防禽脑脊髓炎

正禽脑脊髓炎(AE)自1930年在美国首次报道之后,现已遍及世界各地,当时多是雏鸡发病,后来由于种鸡加强了禽脑脊髓炎的免疫,蛋雏鸡早期获得较好母源抗体保护不至于发病,而产蛋鸡由于无禽脑脊髓炎疫苗的免疫,发病日趋严重,已成为危害家禽业的又一大隐患。现将禽脑脊髓炎病毒在蛋鸡上流行特点、临床症状进行分析,提醒广大蛋鸡养殖朋友加强禽脑脊髓炎的防控,减少经济损失。一、病原特点禽脑脊髓炎病毒(AEV)属于小RNA病毒目小     

禽脑脊髓炎病毒感染雏鸡的病理组织学观察

禽脑脊髓炎(AE)是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)以主要侵害幼鸡中枢神经系统引起非化脓性脑脊髓炎为主要病理特征的急性、高度接触性传染病[1].成年母鸡主要表现为产蛋量有不同程度的下降,雏鸡死亡率可高达57%[2-3].部分存活鸡一侧或两侧眼球的晶状体混浊或呈浅蓝色,严重者失明[4].     

禽脑脊髓炎的防控及研究进展

禽脑脊髓炎（AE）是主要侵害雏鸡的病毒性传染病,以共济失调和快速震颤为特征,该病传播迅速,既可垂直传播,又可水平传播,危害极大。该病病原为禽脑脊髓炎病毒（AEV）,病毒为RNA病毒。     

禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆及序列分析

对禽脑脊髓炎病毒(AEV)陕西分离株SX株VP1基因进行克隆和序列分析,了解VP1基因的分子生物学特征。根据发表的AEV VP1基因序列,设计并合成一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出AEVSX分离株的VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进行序列测定后与已知的AEV毒株序列进行比较分析。结果表明,获得的AEV SX分离株VP1基因的全长为810bp,编码270个氨基酸残基;SX株与参考毒株VP1基因的核苷酸同源性为91.5%～99.4%,推导的氨基酸同源性为88.5%～98.9%;在1～7、19～25、149～155处有3个潜在抗原位点。系统进化树表明,SX株与1143、L2Z参考毒株的亲缘关系较近。     

VP1蛋白可作为禽脑脊髓炎病毒的有效保护性免疫原

禽脑脊髓炎病毒（AEV）是一种重要的家禽病原，是一种小核糖核酸病毒。英国科学家通过重组病毒VP1，VP0，VP3蛋白在杆状病毒系统中的表达研究了禽脑脊髓炎病毒结构蛋白的保护性免疫诱导。体内保护实验表明，VP1蛋白是一个针对禽脑脊髓炎病毒的主要宿主保护性免疫原，病毒中和试验进一步表明，     

禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗安全性、最小免疫剂量及免疫效力试验

为确定禽脑脊髓炎(AE)、鸡痘(AP)二联活疫苗的安全性、最小免疫剂量及免疫效力,自制3批二联活疫苗进行研究。结果显示,鸡接种10倍剂量疫苗后精神、食欲及发育均正常,临床表现和剖检均无异常;AEV YBF02株的最小免疫剂量为100 EID50,鸡痘鹌鹑化弱毒株的最小免疫剂量为10 EID50;3批疫苗AEV YBF02株的病毒含量均≥103.2EID50/羽份,鸡痘鹌鹑化弱毒株的病毒含量均≥103.4EID50/羽份,攻毒后保护指数为89~100。试验表明,自制二联活疫苗安全、有效、质量可控,可用于预防禽脑脊髓炎和鸡痘。     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒(AEV)序列设计了1对引物，利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因，回收、纯化后克隆到T载体中，用常规方法转化JM109感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明，VR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93．0％和97．0％；并将其与其他小RNA病毒进行了比较。