马链球菌兽疫亚种的研究进展

<正>猪链球菌病是当今危害养猪业的一种重要细菌性疾病,严重危害着我国乃至世界养猪业的发展。马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus,SEZ)是引起我国猪链球菌病的主要病原之一。SEZ主要引起猪败血症、脑膜炎、关节炎,肺炎以及突发性死亡等症状~([1])。此外,该菌能感染马、牛、羊、猫等多种动物,实验动物小鼠、兔对该菌也极为易感~([2])。     

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

 【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90％以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。     

猪源马链球菌兽疫亚种类M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。     

猪源马链球菌兽疫亚种的分离与鉴定

从广东省佛山市某养殖场患呼吸道疾病的生猪体内分离到一株致病菌(SSgd0511),通过细菌微量生化鉴定管、革兰氏染色法镜检及16S r DNA基因序列分析鉴定该菌。结果表明,该菌为革兰氏阳性球菌,能利用乳糖、七叶苷、棉子糖、菊糖阳性;16S r DNA基因序列与BLAST比对,结果与马链球菌兽疫亚种的同源性最高,表明本试验分离得到一株马链球菌兽疫亚种。     

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

 【目的】阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性，为疫苗研制提供指导。【方法】利用PCR技术，扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因，并进行克隆、测序及序列分析。【结果】发现7株类M基因长度为1 137 bp，含一个阅读框，CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1 143 bp及1 125 bp。除1株关节炎分离株CP-0104外，引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%，推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源；除CP-0104外，其余8株高变区高度同源。【结论】国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。     

一例豚鼠铜绿假单胞杆菌和马链球菌兽疫亚种混合感染的诊断

对一只突发死亡的宠物豚鼠进行病理学检查、细菌分离培养及鉴定。结果表明,该豚鼠为铜绿假单胞杆菌和马链球菌兽疫亚种的混合感染。豚鼠易携带人畜共患病病菌,人们在饲养应该重视人畜共患病,及时控制人畜共患病的传播,防止其成为人类疾病传染源。     

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。     

马链球菌马亚种新疆株ZX表面蛋白的提取及免疫原性分析

为研究马链球菌马亚种新疆分离株 ZX 表面蛋白的免疫原性,用化学法提取该菌的表面蛋白,用 SDSG PAGE检测提取的表面蛋白,并将提取的表面蛋白与该菌免疫实验兔后产生的抗体及康复马血清反应,利用 WestG ernGblotting和 ELISA试验分析其免疫原性.结果表明,SDSGPAGE电泳可检测到分子量为45,34,33,30,27,20,16 kDa 7条主蛋白带.提取的7条蛋白带多数可与全菌免疫兔的抗体及康复马体内的抗体发生特异性的结合.用提取蛋白和全菌包被 ELISA对马血清的检测表明,二者的阳性吻合率在86．0％.表明提取的表面蛋白具有理想的免疫原性.     

马链球菌马亚种新疆株SeM基因的克隆及序列差异分析

为研究马链球菌马亚种新疆株SeM基因的分子特征,分析新疆地区马链球菌马亚种的分子流行特征以及为马腺疫的防治提供依据,对分离并鉴定的5株马链球菌马亚种提取基因组、扩增并克隆其SeM基因(GenBank登录号分别为:KJ486792、KJ486793、KJ486794、KJ486795、KJ486796),采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行疏水性、抗原性及三级结构分析,并与Genbank登录菌株的SeM基因序列进行系统进化分析和比较。克隆获得的SeM基因长度为1 530bp,包含1个1 527bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;新疆分离株SeM基因与Genbank登录分离株SeM基因同源性为98.0%~99.4%。结果表明,新疆分离株KJ486793、KJ486796与美国分离株亲缘关系较近,属同一个进化分支,另外3株新疆分离株KJ486792、KJ486795、KJ486794构成一个独立分支。     

家禽病例中马链球菌兽疫亚种的分离鉴定及致病性观察

为研究马链球菌兽疫亚种对家禽的致病性,采集流行地区发病鸡和鸽的肺脏,分离了8株链球菌,并利用染色镜检、生化试验和PCR方法进行鉴定,结果为3株属马链球菌兽疫亚种,5株属粪肠球菌。在此基础上,选择1株马链球菌兽疫亚种内蒙分离株,经腹腔注射途径人工感染SPF (Specific pathogen free chicken) 鸡和肉鸡,攻毒后死亡率分别为40%和80%。剖检观察到出血性肺炎、气囊炎和心包炎,尤其是肉鸡出现60%的支气管栓塞病变,这与临床病理学变化相似。此外,采用微量肉汤测定法测定8个临床分离菌株测定对15种药物的最小抑菌浓度(Minimum inhibition concentration,MIC),结果显示10株链球菌对于氟苯尼考、莫西沙星、甲磺酸加替沙星、乳酸环丙沙星及强力霉素高度敏感,MIC值均小于7.813 μg/mL。分离株对于泰乐菌素、磷霉素钠、螺旋霉素和阿莫西林高度耐药,MIC值大于250 μg/mL。试验提示马链球菌兽疫亚种可能是家禽气囊炎一个重要的病原之一,临床防治中应使用敏感性高的抗菌素。     

一株猪源停乳链球菌类马亚种的分离鉴定

【目的】停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）可引起猪关节肿大和运动障碍,大大降低饲料报酬和猪场经济效益,近年研究提示停乳链球菌类马亚种（Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis）是一种潜在的人兽共患病病原。对猪源停乳链球菌类马亚种进行研究,可为防治该病提供数据,具有公共卫生意义。【方法】2022 年 3 月广东省某规模化猪场出现仔猪关节肿大和跛行症状。为确定病因,无菌采集发病仔猪关节液进行细菌分离培养,对优势菌进行形态观察、生化鉴定、16S rDNA 基因序列分析、小鼠致病性试验及抗生素敏感性试验,并对其毒力基因进行 PCR 鉴定。【结果】根据分离菌株的形态特征、生化特性,结合 16S rDNA 序列测定与在线 BLAST 分析结果,确定其为链球菌属的停乳链球菌类马亚种。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢曲松、头孢克洛、青霉素 G、头孢氨苄、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺异恶唑、大观霉素、恩诺沙星敏感,对丁胺卡那、多西环素、多粘菌素 B、诺氟沙星、氨苄西林次敏感,而对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、林可霉素、阿莫西林表现出耐药性。毒力基因 PCR 鉴定结果表明,分离菌株的基因型为 eno+napr+cfb-lmb+bca-bac-scpB+cyl+。小鼠致病性试验结果表明,分离菌株导致小鼠内脏病变和死亡,具有显著的致病性。【结论】首次报道了华南地区有关致病性猪源停乳链球菌病例,研究结果为临床猪源停乳链球菌病的防治提供参考。     

马腺疫链球菌GAPDH重组蛋白的表达及其免疫保护效果的研究

为制备马腺疫链球菌(Streptococcus equi subspecies equi)GAPDH蛋白的多克隆抗体,研究其免疫保护作用。以S.equi分离株为研究对象,利用PCR技术扩增其GAPDH基因并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌。诱导表达重组蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以纯化后的GAPDH重组蛋白免疫小鼠,用酶联免疫吸附法、攻击保护试验检测其免疫效果。结果显示,成功构建了pET-28a-GAPDH原核表达载体,纯化获得30 kDa重组蛋白。该蛋白质能特异性识别该菌抗血清,诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,在初次免疫后第45天,抗体水平效价可达1∶24 300,攻击保护率可达87.5%。该GAPDH重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。     

马疱疹病毒1型gB糖蛋白表位与小鼠C3d串联重组质粒免疫效果分析

为了探究马疱疹病毒1型gB糖蛋白表位与小鼠C3d串联重组质粒的免疫效果。设计合成完整的抗原表位串联体B;以小鼠脾脏总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出小鼠C3d基因;以EHV-1基因组为模板扩增出gB基因;构建重组质粒B-pVAX1、gB-pVAX1、C3d-pVAX1、B-C3d-pVAX1和gB-C3d-pVAX1;转染BHK-21细胞后能正常表达;将重组质粒免疫BALB/c雄性小鼠。结果表明:B-pVAX1免疫组抗体水平、IFN-γ和IL-4相对表达量均高于gB-pVAX1免疫组、C3d-pVAX1免疫组和对照(PBS)免疫组,差异极显著(P0.01);B-C3dpVAX1免疫组抗体水平、IFN-γ和IL-4相对表达量均高于B-pVAX1免疫组、C3d-pVAX1免疫组和对照(PBS)免疫组,差异极显著(P0.01);gB-C3d-pVAX1免疫组抗体水平、IFN-γ和IL-4相对表达量均高于gB-pVAX1免疫组、C3d-pVAX1免疫组和对照(PBS)免疫组,差异极显著(P0.01);重组表位串联体B能够增强小鼠体液免疫和细胞免疫,同时C3d作为分子佐剂具有增强免疫的作用。     

苦马豆素对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响

【目的】探索苦马豆素（SW）与小鼠腹腔巨噬细胞功能之间的关系,为SW免疫研究提供新的试验依据。【方法】将70只小鼠随机分为7组,其中5组分别按0.05、0.2、0.8、3.2和6.4 mg&#8226;kg-1每天灌服SW生理盐水,连续21 d,另2组为生理盐水和空白对照组。收集小鼠腹腔巨噬细胞,经脂多糖（LPS）诱导活化,用ELISA法检测TNF-α生成,酶法检测一氧化氮合酶（NOS）活性,化学法检测H2O2浓度,MTT比色法检测杀伤肿瘤细胞活性及吞噬中性红能力。【结果】SW剂量在0.2～3.2 mg&#8226;kg-1之间,能够提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬和杀伤活性﹑NOS活性,促进TNF-α和H2O2生成,且均呈剂量效应关系;6.4 mg&#8226;kg-1 SW对小鼠巨噬细胞的活性具有抑制作用。【结论】低剂量SW可以通过提高NOS活性介导巨噬细胞信号传递通路,促进TNF-α和H2O2生成,发挥其吞噬和杀伤功能;高剂量SW对小鼠巨噬细胞免疫功能起抑制作用。提示,SW对小鼠腹腔巨噬细胞具有双向调节作用。     

马传染性贫血病马与弱毒疫苗免疫马的区别试验

 本文应用淋巴细胞杂交瘤技术研制出具有抗马传染性贫血病驴白细胞弱毒抗原株系特异性的单克隆抗体（McAb）的酶结合试剂，以斑点试验（DB）与琼脂免疫双扩散试验（ID）相结合的方法，用于马传贫病马与马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马血清抗体的鉴别。使用本方法对339匹实验马进行测试，共检出马传贫病马11匹，马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马239匹，既未接种弱毒疫苗又未感染马传贫马89匹。另外，对106匹人工马传贫病马和21匹马传贫弱毒疫苗免疫马作了病理学验证，结果与免疫学检测相符。疫区在清除病马之后，病情停息。疫苗免疫马经贸易成交，更换畜主后，再次检疫未发现马传贫病例。结果表明，本方法对马传贫病马与马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马的区别诊断有实用价值。     

罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究

为研究无乳链球菌Streptococcus agalactiae表面免疫蛋白(surface immunogenic protein,SIP)微胶囊口服疫苗对罗非鱼Oreochromis niloticus的免疫效果,将制备的无乳链球菌SIP微胶囊疫苗口服免疫健康的罗非鱼,以注射免疫无乳链球菌灭活疫苗为阳性对照,口服包埋PBS的微胶囊颗粒为阴性对照,分别于免疫后0、7、14、28d取脾脏组织,通过实时荧光定量PCR方法检测脾脏组织中的白细胞分化抗原CD4、白介素IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子TNF-α、核转录因子NF-κB等5种免疫相关基因表达的变化,并于第5周进行人工感染攻毒试验,计算无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗对罗非鱼的相对免疫保护率。结果显示,免疫接种之后,SIP微胶囊疫苗口服免疫组(SIP疫苗组)和全菌灭活疫苗注射免疫组(灭活疫苗组)罗非鱼脾脏中的5种免疫相关基因表达均不同程度上调,且相对表达量显著高于阴性对照免疫组(阴性对照组)(P0.05)。在人工感染攻毒试验中,SIP疫苗组和灭活疫苗组的死亡率均显著低于阴性对照组(P0.05),灭活疫苗组比SIP疫苗组得到了更高的免疫保护率,但两组的死亡率差异不显著(P0.05)。说明罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果好,在罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治中有良好的应用前景。     

牛乳源金黄色葡萄球菌ClfA与FnBPA-A重组质粒小鼠免疫保护效果分析

为比较金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)重组质粒ClfA、FnBPA-A以不同组合方式和不同剂量免疫昆明小鼠的免疫效果。提取构建的ClfA、FnBPA-A重组质粒,分别以不同组合和不同剂量免疫昆明小鼠。通过ELISA法检测血清中抗体水平、效价以及对S.aurues的识别能力;通过攻毒后的免疫保护力、脏器菌体含量以及病理组织学观察评价不同免疫策略的免疫效果。结果显示ClfA、FnBPA-A以及联合组免疫后均能产生有效免疫应答和免疫保护力。各项免疫指标的检测均显示联合免疫组的免疫效果优于ClfA、FnBPA-A单独免疫组,高剂量免疫组的免疫效果优于低剂量免疫组。高剂量联合免疫组抗体效价可达1∶12 800,高于其他免疫组,免疫保护力可达100%。脏器菌体含量以及病理组织学观察结果也表明高剂量联合免疫组(ClfA+FnBPA-A)有较强抵抗S.aurues感染的能力。     

雏鸡马立克氏疫苗二次免疫效果试验

1试验方法与结果1.1种鸡场试验。2002年2月邢台市某种鸡场从北京某原种鸡场引进父母代罗曼褐种雏鸡,饲养到56日龄,鸡群开始发病,确诊为马立克氏病,发病死亡率达19.9%。另外,该种鸡场同时还从同一原种鸡场引进一批海兰灰父母代种鸡,此批种鸡发病死亡率为11.8%。怎样才能使今后这     

鸡马立克氏病二次免疫的效果

70日龄鸡在发生马立克氏病初期,紧急接种CV1988疫苗,收到较好效果。死亡率、高峰产蛋率、马立克氏病病死率均极显著（P&;lt;0.01）优于未接种疫苗的鸡群。