雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达

【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶HMGR的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据GenBank中报道的限速酶HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cDNA全长序列;用生物信息学方法对限速酶HMGR进行蛋白结构及功能分析;用半定量RT-PCR方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用HPLC分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶HMGR的基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框长为1 860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT)及2个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEG-CLVA)。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤HMGR蛋白可能为甲羟戊酸(MVA)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。     

豆类丝核菌次级代谢产物与阿霉素的体外联合抑瘤作用研究

［目的］研究豆类丝核菌次级代谢产物与阿霉素的降毒增效作用。方法］分别采用6种不同浓度的豆类丝核菌次级代谢产物（苦马豆素含量分别为10.00、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 μg/ml）处理人肝癌细胞HepG2,测量其IC50;然后用此代谢产物与2种不同浓度（60、6 μg/ml）阿霉素（ADR）联合处理HepG2,分析两者的增效作用。结果］豆类丝核菌次级代谢产物可抑制肝癌细胞HepG2生长,其对HepG2细胞作用72 h的IC50为1.25 μg/ml;ADR可显著抑制肝癌细胞HepG2生长,加入豆类丝核菌次级代谢产物后HepG2细胞的形态和存活率变化不大。结论］豆类丝核菌次级代谢产物与阿霉素体外联合不具有增效作用。     

硫化氢对白桦悬浮细胞中IAA·ABA和次生代谢物累积的影响

[目的]探究硫化氢(H2S)对白桦悬浮细胞中吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)以及多酚和三萜等次生代谢物累积的影响.[方法]采用酶联免疫吸附法、实时荧光定量PCR和比色法等分析IAA和ABA含量及其关键酶基因表达水平、黄酮和三萜等次生代谢物含量.[结果]H2S供体硫氢化钠(NaHS)处理对白桦悬浮细胞中IAA、ABA的累积存在浓度和时间效应,其中1.0 mmol/L H2S供体NaHS处理12 h时ABA含量达最高值,比对照增加了196.46％,而IAA含量在0.1 mmol/L H2 S供体NaHS处理3 h时达最高值,比对照增加了5.55％.ABA或H2 S处理后白桦悬浮细胞中次生代谢产物积累呈增加趋势,而IAA处理则相反.1.0 mmol/L H2 S供体NaHS与不同浓度的IAA和ABA分别处理白桦悬浮细胞24 h后,不同程度地提高了白桦悬浮细胞中多酚、黄酮、三萜含量.其中,1.0 mmol/L ABA与NaHS共同处理后白桦悬浮细胞中多酚、黄酮、三萜含量均达到最大值,分别比NaHS单独处理增加了17.89％、14.74％和8.87％.[结论]H2S处理促进白桦悬浮细胞中IAA、ABA和次生代谢物的累积,H2S与IAA或ABA共同处理可进一步促进次生代谢产物的累积.     

白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长生理的影响

以白桦悬浮细胞为试材,将0.1～5.0μmol/L白桦酯醇添加到培养7 d的白桦细胞悬浮培养体系中处理12 h～14 d,采用比色法分析白桦悬浮细胞活力、丙二醛和NO含量等,解析白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长生理的影响。结果表明,不同浓度白桦酯醇处理12 h～14 d,白桦悬浮细胞鲜重、活力、pH和电导率与同期对照相比无显著差异,其最大值分别在处理后14 d、7 d、14 d和12 h;与同期对照相比,白桦酯醇处理后白桦悬浮细胞中MDA含量、超氧化物歧化酶活性和过氧化物酶活性及其基因表达水平基本呈增加趋势,在处理14 d时达最大值;除1.0和5.0μmol/L白桦酯醇处理显著增加了白桦悬浮细胞中NO含量外,其他处理下NO和亚硝基硫醇含量与对照相比未产生显著影响。可见0.1～5.0μmol/L白桦酯醇对白桦悬浮细胞生长未产生显著影响。     

雷公藤愈伤细胞悬浮培养生产雷公藤甲素的研究

对雷公藤叶愈伤组织进行悬浮培养,研究不同营养条件对雷公藤愈伤细胞生长及其雷公藤甲素质量分数的影响.结果表明：悬浮细胞在White培养基上增殖最快,而在MS培养基上生长最慢;White和MS培养基中悬浮细胞在第6天时雷公藤甲素质量分数最高,分别为7.14 mg/g和4.77 mg/g,而N6培养基中雷公藤甲素最大产量为6.34 mg/g,出现在第9天;3组细胞培养悬浮液中的雷公藤甲素峰值产量分布规律为White（28.13μg/mL）〉N6（21.27μg/mL）〉MS（16.27μg/mL）,同时培养基的pH随细胞的生长有波动现象.     

不同前体对黄芪悬浮培养细胞中黄芪多糖积累的影响

[目的]研究苯丙氨酸、草酸和油酸等前体对黄芪细胞生长和黄芪多糖合成的影响.[方法]在细胞培养的第O天,向细胞悬浮培养液中加入3种前体,测定细胞干重增殖倍数和黄芪多糖的含量.[结果]添加2 mmol/L的草酸可以明显地促进黄芪细胞中黄芪多糖的积累,其含量为对照组的1.80倍;较低浓度苯丙氨酸能有效促进黄芪细胞中黄芪多糖的合成;当苯丙氨酸浓度为1.Ommol/L,黄芪多糖的含量达最大,为33.429 mg/g,为对照组的1.70倍;当油酸添加浓度由0.1mmol/L增加至2 mmol/L时,细胞中黄芪多糖的含量逐渐提高;2 mmol/L的油酸使黄芪多糖的含量达37.565 mg/g,为对照组的1.91倍.[结论]前体的添加可有效促进黄芪悬浮培养细胞中黄芪多糖的积累.     

核黄素诱导烟草悬浮细胞酚类物质和木质素的积累

 【目的】阐明核黄素对烟草悬浮细胞苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性以及抗病相关的酚类物质、木质素等次生代谢产物含量的影响。【方法】1 mmol?L-1的核黄素处理烟草悬浮细胞,用生物化学、细胞化学和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)等方法测定苯丙烷代谢有关的生理和生化指标。【结果】核黄素处理后,PAL和POD活性明显升高,处理12 h 和24 h后酶活性分别达到峰值;荧光观察细胞壁积累了更多的酚类物质,胞内和胞外scopoletin(7-羟基-6-甲氧基香豆素)含量明显升高,在处理12 h后都达到峰值,分别是对照的3.6和3.9倍;细胞染色和含量测定表明,核黄素处理后烟草悬浮细胞沉积了更多的木质素,处理24 h和48 h后,木质素含量分别为对照的1.5和1.8倍。【结论】核黄素处理后提高了烟草悬浮细胞PAL、POD活性,积累了更多与抗病有关的次生代谢产物。     

稀土元素对银杏悬浮培养细胞生长和次级代谢产物积累的影响

稀土元素对银杏悬浮培养细胞生长和次级代谢产物积累的影响试验结果表明，低浓度的硝酸铈铵对银杏细胞的生长影响不大，高浓度则抑制细胞生长，10.0mg/L的硝酸镧对促进细胞生长的效果最好；硝酸铈铵和硝酸镧对银杏黄酮积累的促进作用不明显，但能促进银杏萜内酯的积累，硝酸铈铵的添加浓度以1.0mg/L为好，硝酸镧的适宜添加浓度则培养当天为10.0mg/L、培养第10天为1.0mg/L。     

云南产卷烟中游离氨基酸含量分析

为明确云南产卷烟中游离氨基酸的含量特征,分析了40仹云南产卷烟样品中的19种游离氨基酸含量。结果表明:云南产卷烟的脯氨酸含量最高,达2 270.55μg/g,天冬氨酸含量为220.98μg/g,苯丙氨酸含量为144.03μg/g;谷氨酰胺、缬氨酸、色氨酸、组氨酸、谷氨酸、酪氨酸、胱氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸和丝氨酸含量为10.59～81.37μg/g,异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺和甘氨酸含量均低于10μg/g。除赖氨酸与其他氨基酸不相关外,其余氨基酸之间均存在中等程度或高度相关性。对卷烟品质贡献较大的有酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、缬氨酸和脯氨酸。40仹卷烟样品可聚为3类,聚类结果与样品实际品质较为吻合。     

生长素介导下三唑醇在大豆植株内的传导性

[目的]进一步试验IAA和NAA分别与顶向传导的杀菌剂三唑醇进行耦合的耦合物在大豆苗中的传导性。[方法]用耦合物药液对大豆苗进行喷雾处理,色谱法检测耦合物在大豆苗各部位的含量。[结果]NAA-三唑醇和三唑醇均不能向下传导至根部,而IAA-三唑醇却具有双向传导的特性。0.5 mmol/L IAA-三唑醇处理大豆苗叶片后12 h检测到根部含量为1.87μg/g（FW）,高于此时茎中的含量0.68μg/g,但与同浓度的IAA混合施用时,根中IAA-三唑醇的含量减少到0.80μg/g。[结论]耦合物中IAA基团能引导耦合物向下传导。     

大花红景天悬浮颗粒、悬浮细胞体系的研究

为了探讨大花红景天悬浮体系中红景天苷含量与其颗粒大小、生长状态的关系及可能机制,以大花红景天叶片为外植体,获得愈伤组织,建立悬浮颗粒体系,并分别通过60、80、100和120目细胞筛筛选进而建立悬浮细胞体系。测定了相同培养条件下悬浮颗粒(平均直径约2.5 cm)、悬浮细胞(过80目细胞筛所得)及二者相应培养液中红景天苷的含量。结果表明:经80目细胞筛过滤所得滤液培养一段时间后,可获得大量增殖速度较快、大小均一的悬浮细胞,且这些悬浮细胞中红景天苷含量达0.606 mg/g,约为悬浮颗粒中红景天苷含量0.27 mg/g的2.2倍。而悬浮颗粒和悬浮细胞相应培养液中则均未检测到红景天苷。悬浮体系中细胞与氧气、光照、营养成分的接触程度对培养物中红景天苷的含量有着非常重要的影响。      

培养液中添加硫酸链霉素对蛋白核小球藻生长、细胞组成及α-亚麻酸含量的影响

在培养液中分别添加0(对照组)、20、60、180和540μg/mL的硫酸链霉素(STRS),研究STRS作用下蛋白核小球藻SHOU-1002(Chlorella pyrenoidosa SHOU-1002)生长、细胞组成及α-亚麻酸含量。结果表明：前6天,对照组藻细胞密度显著高于各STRS处理组,第10天对照组生物量及单个细胞干质量均显著大于各STRS处理组。STRS处理组的生物量随培养液中STRS质量浓度的升高不断降低。对照组、20、60和180μg/mL STRS处理组藻细胞叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均随培养时间的延长先降低后升高;540μg/mL STRS处理组藻细胞叶绿素a和叶绿素b含量随培养时间的延长持续下降,而类胡萝卜素前4天快速下降随后趋于稳定。α-亚麻酸是蛋白核小球藻SHOU-1002细胞脂肪酸组成中的优势脂肪酸,且4天后各STRS处理组藻细胞中α-亚麻酸含量显著高于对照组。第10天,180μg/mL STRS处理组藻细胞α-亚麻酸的绝对含量最高(52.09 mg/g),较对照组提升了108.19%;同时180μg/mL STRS处理组的α-亚麻酸产量(35....     

儿茶酚和莨菪碱对水稻纹枯病菌氨基酸合成和分泌的影响

【目的】为明确水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG 1-IA)黑色素形成前体物质酪氨酸等氨基酸成份在不同培养处理中的差异。【方法】利用氨基酸分析仪对水稻纹枯病菌在3种培养处理(PDB对照,添加了300μg/mL质量浓度莨菪碱的PDB和50μg/mL质量浓度儿茶酚的PDB)后菌丝体和发酵液的氨基酸成份进行了分析。【结果】水稻纹枯病菌菌丝体中谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸3种氨基酸含量相对比较丰富,而谷氨酸的含量最高,达到总氨基酸的15.49%;水稻纹枯病菌发酵液中天冬氨酸和谷氨酸含量最为丰富,分别达到了总氨基酸的17.83%和58.21%;在3种处理中,不管是菌丝体还是发酵液中,都是谷氨酸和天冬氨酸最为丰富。影响水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成的前体物质酪氨酸的含量在3种处理的菌丝体中没有显著差异;但300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组中的苯丙氨酸含量都存在显著差异,而对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组的苯丙氨酸含量差异不显著。水稻纹枯病菌发酵液中对照组和50μg/mL质量浓度的儿茶酚处理组酪氨酸含量没有显著差异,但是300μg/mL质量浓度的莨菪碱处理组与对照组和儿茶酚处理组酪氨酸含量都存在显著差异,而苯丙氨酸在发酵液中差异不显著。【结论】影响水稻纹枯病菌菌丝体和发酵液黑色素形成的氨基酸不同,苯丙氨酸对水稻纹枯病菌菌丝体黑色素形成更加重要,而酪氨酸对水稻纹枯病菌发酵液黑色素形成更加重要,以上结果为氨基酸对水稻纹枯病菌黑色素形成的影响提供了参考依据。     

不同提取方法对家蝇幼虫体外抗炎活性的影响

为比较水提法、碱提法、盐提法及醇提法对家蝇幼虫体外抗炎活性的影响,以脂多糖诱导的巨噬细胞为 研究对象,结合不同方法所获产物的产率、蛋白含量等,探明4 种方法所获提取物对细胞形态及TNF 琢、MCP-1 分泌 的影响。结果表明,碱提法所获产物的产率最高,其次是水提法、盐提法和醇提法;水提法所获产物的蛋白含量最高, 其次是盐提法、碱提法和醇提法;水提法所获产物的体外抗炎活性最优,其次是醇提法、盐提法和碱提法。     

槟榔碱合成前体物质的空间分布及槟榔碱合成通路解析

为探究槟榔中的生物活性成分,本研究以不同组织的槟榔为材料,利用高效液相色谱?质谱联用技术进行了非靶向代谢组学检测,经过定性分析,共获得了158个代谢物（包括氨基酸、脂质、核苷酸、生物碱和类黄酮等物质）,首次在槟榔中发现槟榔次碱己糖苷的存在,并对氨基酸和生物碱进行了相对定量,发现芳香族氨基酸和支链氨基酸主要分布在种子中;烟酸衍生物在叶片中含量较高,槟榔次碱己糖苷和去甲基槟榔碱在外果皮中含量较高,其余生物碱均显示出在果实中尤其是种子中有较多的积累。基于烟酸、葫芦巴碱和槟榔碱的结构相似性,推测槟榔碱的合成通路是以天冬氨酸为起点,以烟酸、葫芦巴碱为基本骨架进行合成的。     

6种生物碱对斜纹夜蛾离体培养细胞的作用方式

通过倒置显微镜观察斜纹夜蛾细胞凋亡小体,采用MTT法测定细胞增殖抑制作用,并使用流式细胞仪检测细胞周期时相,研究了骆驼蓬碱、喜树碱、蓖麻碱、苦参碱、博落回碱和烟碱对斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1的作用方式和细胞毒理。结果表明:骆驼蓬碱5.0μg/mL、20.0μg/mL和喜树碱0.5μmol/L、1.0μmol/L处理后48～60 h,斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1表现出明显的细胞凋亡诱导作用,处理后12～48 h,明显抑制SL-1细胞增殖,流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G2/M期;博落回碱和蓖麻碱5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用,以20.0μg/mL处理具有细胞周期时相阻滞作用,同样使细胞阻滞于G2/M期,但无明显的细胞凋亡诱导作用;烟碱和苦参碱在5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用。     

雷公藤高内酯醇含量无性系的早期选择

2年生雷公藤无性系苗木的根韧皮部、根木质部的内酯醇含量质量分数分别为0.0024%、0.0031%,根木质部的内酯醇含量是根韧皮部的1.29倍;23个无性系苗木的根韧皮部、根木质部的内酯醇含量差异达显著水平;通过联合选择,选出2个高内酯醇含量无性系、1个兼有速生及高内酯醇含量双优性状的优良无性系。     

人参内生菌提取物对硝酸盐胁迫下番茄幼苗生长及氮代谢相关指标的影响

以番茄幼苗为试验材料,研究不同浓度(10μg/ml、5μg/ml和1μg/ml)的人参内生菌(Alternaria sp.)提取物在Ca(NO3)2胁迫(75 mmol/L)下对番茄幼苗生长及氮代谢相关指标的影响。结果表明,与清水对照相比,硝酸盐胁迫处理下番茄幼苗生长受到抑制,可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、硝态氮含量和氮代谢相关酶活性均受到影响。人参内生菌提取物浓度为5μg/ml的处理明显缓解了硝酸盐胁迫对番茄幼苗生长造成的伤害,显著提高了可溶性蛋白含量、硝酸还原酶(NR)活性、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性,并显著降低了脯氨酸含量,说明5μg/ml人参内生菌提取物处理对硝酸盐胁迫下番茄幼苗生长和氮代谢的调节效果最佳。     

富硒和γ-氨基丁酸萌芽糙薏米培养液组分的工艺优化

为提高糙薏米中γ-氨基丁酸的富集量,采用响应面试验法对糙薏米的培养液组分进行工艺优化。结果表明:培养液中Na2SeO3浓度以10mg/L为宜,其发芽率最高,达(90.33±1.73)%;在Na2SeO3浓度为10mg/L的培养液中辅以11mmol/L CaCl2、87.7μmol/L GA3和31.5mmol/L MSG进行萌芽处理时,萌芽糙薏米中总硒、有机硒和GABA含量分别达0.42mg/100g、0.37mg/100g和116.69mg/100g,是一种具高值化产品开发潜力的保健食品基料。     

诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响

[目的]雷公藤甲素是雷公藤主要药用活性成分之一,具有抗肿瘤、免疫抑制和抗炎等多种作用.应用植物细胞培养技术生产雷公藤甲素具有重要意义,而诱导子是提高植物细胞培养中次生代谢产物积累的有效途径之一.研究通过探究非生物和生物诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响,以期提高雷公藤甲素产量,为雷公藤悬浮细胞规模化生产雷公藤甲素等药用活性物质提供基础.[方法]以水杨酸(SA)、LaCl3以及雷公藤内生真菌NS-5、NS-17作为诱导子,研究不同类型及不同浓度诱导子添加对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累及细胞活力、细胞生长、总糖消耗、PAL活性的影响.[结果]SA、LaCl3和内生真菌NS-5、NS-17诱导子均可促进雷公藤悬浮细胞培养物中雷公藤甲素的积累.非生物诱导子的效应大小受其浓度的影响,0.1 mg/L的SA诱导作用最好,可提高细胞活力,促进细胞生长,总糖消耗增加,升高PAL活性,雷公藤甲素产量最高是对照的3.5倍.随着浓度的降低,LaCl3对雷公藤甲素的诱导作用增强,20 mg/L LaCl3诱导下的最高含量是对照的2.0倍,同时20 mg/L LaCl3也提高了PAL活性和总糖消耗,但对细胞活力和细胞生长影响不大.内生真菌诱导子的效应大小即与诱导子种类和添加时间有关.细胞培养第4天添加NS-5、NS-17菌丝体提取物,第8天添加任一内生真菌诱导子均提高了雷公藤甲素的积累,其中NS-5菌丝体提取物的诱导效果相对最强,细胞培养第8天添加时雷公藤甲素产量最高,是对照的2.4倍,但雷公藤甲素的积累与细胞生长及PAL活性无明显的关联.[结论]诱导子的添加能够提高雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素的积累,诱导效应的大小与诱导子种类、添加浓度及添加时间有关.本研究中的0.1 mg/L SA、20 mg/L LaCl3及内生真菌NS-5菌丝体提取物显示了良好的诱导效果,在利用细胞培养技术进行雷公藤甲素生产中具有较好的应用前景.