不同牛种GH基因外显子5序列变异研究

在测定牛亚科3个牛种(雷琼牛、巴州牦牛和巴州蒙古牛)GH基因外显子5序列的基础上,分析了不同牛种的序列变异特点,同时引用其它牛种(普通牛、瘤牛、牦牛和水牛)的序列构建分子系统树以探讨牛亚科家畜的系统发生关系.结果表明,在雷琼牛、巴州牦牛和巴州蒙古牛中共检测到5个变异位点,核苷酸取代方式仅有转换和颠换,核苷酸平均突变率仅为1.66%,说明这3个牛种GH基因外显子5多态性较为贫乏;5个变异位点中仅有1个为错义突变,导致亮氨酸和缬氨酸的转换,但该突变在牛种中分布有差异.从构建的系统树来看,普通牛与瘤牛先聚为一类,然后再与牦牛聚在一起,最后才与水牛聚在一起,与已有的分类结果大体一致.本研究的结果支持中国南方可能是一支瘤牛发源地的推论,也支持中国牦牛在起源进化历程中可能与瘤牛发生了基因交流的观点.     

中国4个牛种MSTN基因外显子2多态性分析与其系统发生关系研究

[目的]解决牛亚科动物近缘物种的分类归属问题,了解牛亚科各种群遗传多样性。[方法]采用酚-氯仿抽提法从4个中国牛种中提取基因组DNA,对MSTN基因进行PCR扩增和测序,构建系统发育树,探讨4个牛种间MSTN基因外显子2的系统发生关系。[结果]MSTN基因外显子2编码区为372 bp。蒙古牛、牦牛和独龙牛的MSTN基因外显子2具有丰富的多态性。在所测66个样本中存在3个核苷酸多态位点,定义了6种单倍型。雷琼牛、蒙古牛、独龙牛与巴州牦牛享有共同的单倍型。巴州牦牛独自聚成一支,而雷琼牛与一部分独龙牛、大部分蒙古牛和引用瘤牛聚成一支。[结论]蒙古牛、雷琼牛、独龙牛种间存在着基因交流。牦牛与普通牛、瘤牛的分化较明显,比瘤牛与普通牛的亲缘关系要远。     

牛亚科6个群体LYZ基因序列分析及系统进化研究

对牛亚科6个群体溶菌酶(LYZ)基因的编码区核苷酸序列进行PCR扩增和测序,结合GenBank上海福特牛该基因编码区核苷酸序列进行比对分析,并采用邻接法构建分子系统进化树.结果表明:在榆测的样本中(水牛除外),有5个核苷酸多态位点,定义了9种单倍型;群内核苷酸多样性(P1)在0.000 00～0.001 96之间.说明群体内遗传多样件程度较低.构建的分子系统发育树表明,瘤牛、蒙古牛、鲁西黄牛间关系密切,瘤牛和普通牛与牦牛关系相对较近,而与大额牛关系相对较远.     

基于细胞色素b基因序列的中国牛亚科家畜系统发育关系

 【目的】探讨中国牛亚科家畜物种间的系统发育关系,为牛亚科家畜的系统演化历史提供分子证据。【方法】采用PCR产物直接双向测序法,获得普通牛、瘤牛、牦牛、大额牛、沼泽型亚洲水牛和河流型亚洲水牛共6个物种的线粒体DNA Cyt b基因全长序列,运用分子进化软件分析物种间的系统发育关系。【结果】6个牛种的Cyt b基因序列长度均为1 140 bp,没有观察到插入/缺失突变,共检测到220个变异位点,包含213个简约信息位点;Cyt b基因序列变异中转换数明显高于颠换数,转换数和颠换数的比值为5.2,突变没有达到饱和状态。由遗传距离可知,普通牛与瘤牛的亲缘关系最近,而它们与大额牛、牦牛、沼泽型亚洲水牛、河流型亚洲水牛的亲缘关系依次逐渐疏远。牛亚科家畜6个物种分布于4个主要的单系群分支,可划归为家牛属、牦牛属、准野牛属和水牛属;牛种间的分歧时间在0.775—6.43 MYA,亚洲水牛与其它牛种间的分歧时间最长,普通牛与瘤牛的分歧时间最短。大额牛和印度野牛的单系性都没有得到显现,大额牛和印度野牛在线粒体DNA水平上不能清晰地相互区分。【结论】中国牛亚科6个牛种划分为4个分支,分别对应于家牛属、牦牛属、准野牛属和水牛属,家牛属与准野牛属、牦牛属、水牛属的亲缘关系逐渐疏远;6个牛种间的进化分歧时间在0.775—6.43 MYA。大额牛与印度野牛的亲缘关系非常近,两者在较早的世代具有共同的母系起源;不支持大额牛是印度野牛的家养型或驯化种的观点,它们有可能都是现已灭绝的某种野生牛的后代。     

牛生长激素基因外显子5序列变异及其分子进化特征

通过双向直接测序法测定中国5个牛种生长激素(GH)基因外显子5序列,并且在分析序列变异的基础上探讨GH基因外显子5序列的分子进化特征.序列分析表明,5个牛种GH基因外显子5的遗传变异水平较低,平均核苷酸变异率约为3.48%,而且绝大多数位点的核苷酸替换是同义突变,仅发现1个错义突变位点;从GH基因外显子5序列单倍型构建的分子进化树来看,水牛与普通牛、瘤牛、牦牛及大额牛的分化相对比较明显,其他4个牛种之间并无明显分化,还享有共同的祖先序列.研究结果也说明牛GH基因外显子5在进化过程中由于功能的约束表现相当保守,进化速率缓慢.     

渤海黑牛和日本和牛mtDNAD-loop区遗传变异研究

研究渤海黑牛和日本和牛线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)的遗传变异。采用DNA测序技术测定了这2个品种17个个体mtDNA D-loop区全序列,从Genbank下载了31头日本和牛、9头渤海黑牛、2头欧洲普通牛、2头瘤牛以及21个其他中外黄牛品种mtDNA D-loop区全序列,用lasergene和Mega 4.0.1软件对所得的渤海黑牛和日本和牛57个个体的序列进行了遗传多样性研究,并对渤海黑牛、日本和牛、欧洲普通牛和瘤牛的mtDNAD-loop区全序列进行了同源性分析。以水牛为外群,对23个中外黄牛品种的聚类分析显示它们聚为2类:欧洲型原牛和瘤牛型原牛。渤海黑牛含有这2类的遗传背景,受到过瘤牛血缘渐渗的影响。而日本和牛则来源于欧洲原牛。结论:渤海黑牛和日本和牛mtDNA D-loop区具有丰富的遗传多样性,二者的亲缘关系很近;渤海黑牛含有普通牛和瘤牛的血统、受到过瘤牛血缘渐渗的影响;日本和牛属普通牛类型,欧洲原牛、朝鲜牛和我国北方的部分牛种对于日本和牛的形成可能都起到丰富种群的作用。     

郏县红牛细胞色素B序列测定及多态性分析

以郏县红牛基因组DNA为模板,对mtDNA Cytb全序列进行扩增、测序、序列核苷酸组成分析、序列的变异和多态性分析,得出2点结论:①mtDNA基因全序列长度均为1 140 bp,不存在序列长度差异,富含A和T。②全序列比对与普通牛仅有1个突变位点,与瘤牛有8个突变位点。     

欧拉型藏羊生长激素基因部分片段的Sma Ⅰ-RFLP 分析及序列比较研究

对35只欧拉型藏羊生长激素(GH)基因部分片段进行Sma Ⅰ-RFLP分析,并对该基因片段进行PCR产物直接测序(GenBank accession NO.:EF030552).在此基础上,利用BioEdit 7.0.0、DnaSP 4.10.1和Mega 3.1等生物软件,将该序列与GenBank中山羊、普通牛、牦牛、水牛、赤鹿和长颈鹿6个物种相应基因序列进行比对分析,结果表明:该片段Sma Ⅰ-RFLP均为单态,表现为AA型;其核苷酸序列与山羊、普通牛、牦牛、水牛、赤鹿、长颈鹿的序列间同源性分别为97.3%、94.8%、94.6%、95.3%、91.2%和91.2%;根据外显子5和部分外显子4进行氨基酸序列预测和比对分析,欧拉型藏羊与山羊氨基酸序列完全相同,同源性达100%,与普通牛、牦牛、水牛、赤鹿、长颈鹿的序列间同源性均为98.8%.采用NJ法构建的物种间分子系统进化树进行聚类分析结果表明,欧拉型藏羊与山羊聚在一起;普通牛与牦牛聚为一类后,再与水牛聚在一起;最后这两类再与赤鹿和长颈鹿聚类,其结果与动物学分类一致.     

微卫星DNA标记对5个中外黄牛品种／群体遗传结构的研究

利用4种微卫星DNA标记对南阳牛、延边牛、韩牛、西门塔尔牛、皮埃蒙特牛×南阳牛杂种5个品种／群体的等位基因频率、杂合度、有效等位基因数、遗传距离等进行了遗传检测,在此基础上又进行了聚类分析。从分子水平上揭示了中国牛与外国牛、瘤牛与普通牛品种间的遗传结构关系。     

甘南牦牛H-FABP基因CDS区多态性及生物信息学分析

应用PCR产物混合样本DNA池法检测甘南牦牛心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因CDS区多态性,并应用生物信息学方法分析甘南牦牛H-FABP蛋白质特性.结果表明:甘南牦牛H-FABP基因CDS区序列与九龙牦牛相同,而与普通牛对比在第3外显子存在*76G>A的同义突变;甘南牦牛H-FABP氨基酸序列没有明显的疏水性区域,也未形成跨膜螺旋区及信号肽,推测其主要在细胞质中发挥生物学作用;甘南牦牛H-FABP基因编码产物二级结构是以α-螺旋和β-折叠为主的mixed型;氨基酸序列与普通牛、山羊、马、人、小鼠、大鼠、鸡、草雀及绿鸭9个物种间同源性较高,与其实际亲缘关系远近一致.     

3个黄牛品种Y STR多态性

利用14个家牛Y染色体特异性微卫星标记分析秦川牛、大别山黄牛和郧巴黄牛3个品种Y染色体多态性。UMN0920和UMN2303标记呈现不规则梯状条带,不适于研究中国黄牛Y染色体多态性。5个标记(UMN2908、UMN3008、UMN3007、UMN2001和UMN0504)呈现单态,另外7个标记(UMN0108、UMN2404、UMN0929、INRA189、UMN0905、UMN0103和UMN0803)表现多态,能用于中国黄牛Y染色体多态性分析。3个品种在7个多态标记的期望杂合度分别为0.412、0.442和0.470,多态信息含量分别为0.319、0.349和0.374,说明3个黄牛品种Y染色体上呈现中度多态。UMN2404和INRA189标记对所有公牛的瘤牛和普通牛单倍型鉴别率达到100%的一致,瘤牛和普通牛单倍型频率为17.3%和82.7%。瘤牛和普通牛单倍型频率在3个黄牛品种中频率不同,但普通牛单倍型为优势单倍型。     

务川黑牛微卫星座位遗传多样性分析

以贵州地方牛优良品种务川黑牛为研究对象,选取分布于其7条染色体上的ETH10、ILSTS033、CSSM66、BM2113、ETH225、BM1818和CSRM60共7对微卫星引物进行遗传多样性分析。结果共检测到21个等位基因,每个微卫星座位等位基因数为2～5个,7个微卫星座位均未达到Hardy-Weinberg平衡。7个位点的平均等位基因数、平均有效等位基因数、平均期望杂合度、平均多态信息含量分别为3.000 0±1.154 7、2.377 3±0.585 4、0.558 4±0.101 6、0.475 9±0.125 1,说明务川黑牛具有良好的遗传多样性。为务川黑牛种质资源保存和改良提供了试验基础。     

黄牛与牦牛 ANGPTL4_exon5多态性与生长性状的相关性

以5个地方黄牛及青海牦牛为研究对象,利用PCR-SSCP和DNA测序技术对367头黄牛与牦牛的类血管生长因子4基因的第5外显子（ANGPTL4_exon5）序列进行SNP检测,并分析该SNP与黄牛与牦牛生长性状的相关性。结果发现1个新的SNP多态位点（NC₀07305:g.C4899T）,并检测出CC、TT和CT3种基因型。黄牛和牦牛不同基因型与生长发育性状的相关分析显示,黄牛TT基因型个体的体质量（399.096±32.946）kg、体斜长（147.447±4.456）cm、胸围（175.188±5.814）cm和腹围（204.657±7.113）cm,显著大于CT基因型个体,依次为（275.636±51.266）kg、（126.470±6.933）cm、（154.031±9.047）cm、（178.911±11.069）cm,其余各项指标基因型间差异不显著。因此,该位点有可能作为黄牛生长性状辅助选择的标记之一。青海牦牛群体中没有发现与该基因座多态显著相关的性状。     

5个绵羊群体微卫星标记的遗传多态性分析

为评估5个绵羊群体(160只个体)的遗传多态性,对5个微卫星座位(BM2113,ILSTS0004,GC101,Bulge5,471U)进行研究.结果表明,共发现了82个等位基因,其中在471 U座位的等位基因数最多(23个),ILSTS0004座位的等位基因数最少(13个).多态信息含量、期望杂合度和观察杂合度分析表明,5个绵羊群体均存在遗传多态性,各座位等位基因均较丰富.德国美利奴羊和滩羊的遗传多样性比较丰富,蒙古羊的遗传多样性较低.以Nei氏遗传距离(DA)构建NJ系统发育树,蒙古羊和滩羊、德国美利奴羊和德美寒杂交一代分别先聚为一类,最后才与小尾寒羊聚为一类.     

牛BRY基因的分子克隆及序列分析

以荷斯坦奶牛、西门塔尔牛和甘南牦牛为观测对象,利用Y染色体上特异性序列BRY基因进行性别预测,并对其进行PCR扩增、分子克隆及序列分析;最后以牛基因组DNA为模板,利用牛BRY基因作为雄性特异性基因,ZFX/ZFY作为内标基因进行双重PCR.结果表明:公牛可获得长度约为300 bp和445 bp两条扩增带的PCR产物,母牛则仅获得1条长度约为445 bp的PCR产物,与实际性别完全相符,说明该基因可用于牛的性别预测.对BRY-PCR产物克隆测序,得到300 bp的BRY基因部分核苷酸序列,与GenBank上登录的牛和绵羊的同源性序列进行比对发现,同源性都高于87.0%,表明哺乳动物的BRY基因具有高度保守性,种间差异很小.     

鲁西牛ANGPTL6基因的3个多态位点与其生长性状的关联性分析

【目的】揭示鲁西牛ANGPTL6 (angiopoietin-like protein 6)基因的遗传变异特征,发现与鲁西牛生长性状显著相关的候选分子标记,为鲁西牛分子育种积累基础资料。【方法】以183头鲁西牛血样为材料,运用DNA池测序和PCR-RFLP等技术检测ANGPTL6基因的序列变异。【结果】检测到鲁西牛ANGPTL6基因内含子中3个新的SNPs。χ2检验表明这3个多态位点均处于哈代-温伯格平衡状态（P＞0.05）。遗传变异特征分析显示,T2359C 和 G3258T位点属于中度多态性,C2403A位点属于低度多态性。连锁不平衡和单倍型分析表明,鲁西牛ANGPTL6基因3个多态位点之间为弱连锁,单倍型TCG（野生型）属于优势单倍型（频率为44.3%）。方差分析表明,单个的SNP和不同SNPs之间的组合均与鲁西牛生长性状有着显著或极显著的关联,杂合型个体的生长性状指标均高于纯合型个体。【结论】鲁西牛ANGPTL6基因的3个SNPs与其生长性状显著相关,并且杂合基因型个体明显优于纯合基因型个体,此结果可以应用于鲁西牛的分子育种实践。     

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase,HSL）基因在牦牛中的遗传多态性,进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性,同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据,寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在3种基因型;②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余多态位点均偏离;③测序分析表明,H-FABP基因外显子4第7 339位（与原序列相比）发生单碱基突变（T→C）,该突变属同义突变;HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换,以及第6816处发生碱基A→G突变,并导致编码氨基酸由天冬氨酸（D）转变为甘氨酸（G）;外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变,编码氨基酸由半胱氨酸（C）变为甘氨酸（G）;④对各标记基因型生长发育指标（体高、体斜长、胸围、管围、体重）进行差异显著性检验,仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著（P﹤0.01）。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性,且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。     

用20个微卫星标记研究鲁西黄牛和渤海黑牛的遗传多样性

用20个微卫星座位分析了鲁西黄牛、渤海黑牛及用作参照的秦川牛品种的遗传多样性。3个中国黄牛品种在20个座位的等位基因数为4~25个,平均等位基因数接近9个。各座位等位基因长度与欧洲普通牛相似,但平均等位基因数高于报道的欧洲普通牛和部分中国其它黄牛品种。3个品种在不同座位均发现部分特有基因,以渤海黑牛居多,在3个座位检测到7个特有基因。平均有效等位基因数达到6个以上,平均杂合度接近0.8,平均多态信息含量约为0.85,这几项变异参数在3个品种间没有明显差异,但高于欧洲普通牛群体和报道的中国部分黄牛群体的相应值。结果表明,3个品种在当地生态条件下,经数千年的选育积累了丰富的遗传变异,属宝贵的遗传资源。遗传相似度分析结果显示,渤海黑牛先与秦川牛聚为1类,再与鲁西黄牛聚在一起,引证了鲁西黄牛受瘤牛血统影响较大的结论。