枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑茵活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因（CSrlo该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99％,氨基酸序列相似性为98％,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株xF一1对稻瘟病菌Magnaportheoryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophorabrassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株xF－1和B168的CSFI基因在大肠杆菌Escherichiacoli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是xF－1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。     

通过染色体整合几丁质酶基因提高伯克氏菌生防能力

为了提高伯克氏菌Burkholderia vietnamiensis的生防能力,通过Tn5转座子介导,将其携带的来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的几丁质酶基因整合到野生伯克氏菌B418染色体DNA上,获得工程菌株B418-37。对获得的转化子进行Southern杂交和几丁质酶活性检测,结果证实几丁质酶编码基因已整合到伯克氏菌B418-37染色体DNA上并能表达几丁质酶。生物学特性研究发现几丁质酶基因整合到伯克氏菌染色体中,没有影响野生菌的解磷、解钾、固氮及其在植物根际的定殖能力。平板抑菌试验和温室盆栽试验显示,与野生型相比,该工程菌株对多种病原真菌的抑菌效果增强,说明几丁质酶在植物病害的防治中具有重要作用。上述结果说明通过染色体整合几丁质酶基因是获得多功能生防工程菌的有效途径之一。     

球孢白僵菌SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

几丁质酶在昆虫真菌侵染寄主过程中起着重要的作用。本文对采自内蒙古准格尔旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05进行了几丁质酶的基因分析,从中克隆了几丁质酶Bbchit基因,得到了重组质粒pMD19-T/chit。测序结果表明,Bbchit基因核苷酸序列阅读框架全长为1047 bp,编码348个氨基酸,推测分子量为36.924 ku,等电点为5.94。氨基酸序列比对结果表明,与球孢白僵菌Bb0062菌株（AAN41259.1）的氨基酸序列相似性最高,为99.71%。     

白僵菌培养基继代培养对蛋白酶（cdep1）、几丁质酶（chit1）基因表达的影响

[目的]对球孢白僵菌D6-2和L1-1菌株进行室内培养基继代培养,比较其不同世代之间毒力及毒力相关基因表达之间的差异.[方法]对目的菌株进行室内生物测定,用LT50和LT90作为毒力评价标准来检测不同世代之间毒力的变化情况.为了明确继代培养对球孢白僵菌毒力相关酶基因表达情况的影响,以18S rDNA基因为内参,利用半定量RT-PCR对蛋白酶cdep1基因和几丁质酶chit1基因的表达情况进行检测.[结果]在107孢子/mL供试浓度下,随着世代的更替,两个供试菌株F2代相比于F1代,其LT50和LT90降低,说明其对玉米螟的毒力有所增强.而两个供试菌株F2～F5代对玉米螟的毒力呈下降趋势.在内参基因稳定表达的情况下,两个供试菌株L1-1和D62的cdep1基因和chit1基因在F1和F2代表达稳定,随着继代次数的增多,供试菌株两个基因的表达量均呈下降趋势,这与对亚洲玉米螟毒力测试的结果呈正相关性.[结论]F2代毒力和毒力酶基因表达最强,F1代与F2代基本相似或略低于F2代,F2～F5代毒力和毒力酶基因表达依次减弱.     

木霉几丁质酶及其基因的研究进展

现已报道8种木霉的39个几丁质酶基因,其中22个为42kD内切酶基因.这些42kD内切酶基因的核苷酸序列及其编码的前体蛋白的氨基酸序列极为相似.42kD几丁质酶基因开放阅读框一般有3个内含子,前体蛋白一般有约22AA的信号序列,引导输出.成熟蛋白具有催化域、磷酸化域和耱基化域.基因的表达是诱导型的,受几丁质及真菌几丁质细胞壁的强诱导,受代谢物阻遏.转入植物的木霉几丁质酶基因可正确表达.本文就木霉生防菌株几丁质酶及其基因克隆、几丁质酶基因结构和功能、几丁质酶基因的表达和调控,以及木霉几亍质酶的生防应用前景等几方面进行了综述.     

拟康宁木霉T 51几丁质酶活性及内切几丁质酶基因克隆与分析

木霉是一类重要的生防真菌,木霉产生的几丁质酶在其生物防治的重寄生过程中起着重要作用。拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis T-51是一株对番茄灰霉病有生防潜力的木霉菌株,本文测定了T-51菌株产生几丁质酶的活性,结果表明T-51在PDB中液体培养以及与灰霉病菌在PDA上对峙培养时产生的几丁质酶活性显著受到灰霉病菌的诱导。采用RACE技术首次克隆了拟康宁木霉T-51中一个几丁质酶基因Tkchit42,全长为1 817bp,包含4个外显子和3个内含子。预测该基因有一个1 275bp的开放阅读框,编码424个氨基酸,预测的蛋白总分子量为46.378kDa,预测的等电点(pI)为5.16,与T.koningii中42kDa内切几丁质酶的氨基酸序列相似性达到99%。     

寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。     

几丁质酶基因在球孢白僵菌中的超表达提高其对马尾松毛虫的毒力

几丁质酶在虫生真菌穿透寄主体壁的过程中起一定作用,但其与真菌毒力的关系尚不清楚。本研究通过几丁质酶基因在球孢白僵菌Beauveria bassiana中的超表达以及超表达菌株的毒力变化研究了该基因与毒力的关系。将几丁质酶基因Bbchit1通过芽生孢子转入野生型球孢白僵菌中,获得多拷贝的转化子;转化菌株在胶体几丁质诱导培养基中酶活最大值高于出发株4.2倍,表明该几丁质酶基因在转化菌株中得到超表达。毒力测定发现转化子对马尾松毛虫Dendrolimus punctatus的致死中浓度比出发株降低84.5%,在2.5×107孢子/ml浓度下的致死中量减少84.5%,致死中时缩短0.7d,因此毒力大大提高。第2~9d感病死虫数与转化子第1~8d酶活呈极显著正相关（P〈0.01）,而与出发株不相关（P〉0.05）。这些证据表明,几丁质酶与毒力的关系是复杂的,在分泌达到一定阈值后与毒力才有明显的相关关系。     

黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1的克隆、表达及抗菌活性

 为研究黄蓝状菌（Talaromyces flavus）几丁质酶性质和作用,通过RT PCR、3′ RACE及5′ TAIL PCR技术克隆了一个黄蓝状菌几丁质酶基因tfchi1,该基因全长为2 561 bp,含有6个内含子,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分子量为43.47 kDa,属于糖苷水解酶第18家族。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体pPIC9K/tfchi1,并转化毕赤酵母,筛选得到一株高效表达几丁质酶的工程菌GS TFCHI1 9,甲醇诱导第7 d酶活性最高,达32.29 U·mL-1。SDS PAGE检测纯化重组蛋白的分子量约44 kDa。重组几丁质酶Tfchi1最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.5,在pH 6～8之间稳定。Zn2+、Cu2+对 Tfchi1活性有明显的抑制作用。抑菌活性测定结果显示,Tfchi1可明显抑制敏感植物病原真菌的菌丝生长和分生孢子萌发。该酶在几丁质资源的开发利用和生物防治等领域具有较广的应用前景。     

绿色木霉几丁质酶基因Tvchi cDNA的克隆、原核表达与活性分析

 利用RT PCR方法从绿木霉ZBS 6中扩增了几丁质酶基因Tvchi,序列分析表明Tvchi 开放阅读框为1 293 bp,编码430个氨基酸残基,Blast 分析表明,与多种木霉18家族内切几丁质酶具有较高的同源性。将该基因克隆到原核表达载体pET 28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS PAGE和Western印迹分析表明成功的获得了47 kD 的融合蛋白。该融合蛋白经Ni NTA柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白Tvchi。Tvchi最适酶活温度为37℃,最适酶活pH值为6.8。表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为进一步研究木霉几丁质酶的应用提供了基础。     

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌蛋白的分离及鉴定

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株对灰葡萄孢菌具有较强的抑菌活性,抑菌蛋白是其产生的抑菌物质之一。本研究为明确NCD-2菌株所产抑菌蛋白的作用方式和特性,采用牛津杯法测定抑菌蛋白的抑菌活性及其对病原菌菌丝生长的影响,采用混合培养法测定其对病原菌分生孢子萌发的影响,同时采用阴离子交换层析和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其进行分离纯化,并利用MALDI-TOF-MS进行鉴定。结果表明,NCD-2菌株产生的粗蛋白能够显著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌发和菌丝生长,并导致病原菌菌丝分枝增多、局部膨大肿胀。通过分离纯化获得具抑菌活性的蛋白组分D1-3,经鉴定该蛋白的肽指纹图谱与leucyl aminopeptidase[Bacillus subtilis](WP_041057629.1)的氨基酸序列匹配率最高,达到65%,相对分子质量为53.936 k Da,功能分析表明组分D1-3可能是一种新的抑菌蛋白。     

枯草芽孢杆菌G3菌株的抗菌物质及其特性

 产几丁质酶枯草芽孢杆菌G3菌株的固体培养物在黄瓜灰霉病菌和番茄叶霉病菌抑菌试验中证实,抑菌活性物质存在于过滤上清液中,它们是从酸沉淀物中提取出的伊枯草菌素、生物表面活性素和存在于盐析粗蛋白中的几丁质酶。在叶霉孢子萌发试验中,伊枯草菌素微弱地抑制孢子萌发但强烈破坏芽管和新生菌丝;生物表面活性素和几丁质酶则强烈抑制孢子萌发并长久性地抑制芽管伸长。在PDA平板上的灰霉菌丝抑菌试验中,伊枯草菌素抑制菌丝生长,引发菌丝顶端膨大,形成泡囊,泡囊破裂后原生质外泄;几丁质酶抑制菌丝生长,引发产生不规则的菌丝团;生物表面活性素在平皿上对菌丝则不显示出抑菌活性。     

脂肽类抗生素fengycin在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑制番茄灰霉病菌中的功能分析

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株及其无细胞发酵液对多种植物病原真菌具有较强的拮抗活性。为了明确NCD-2菌株抑菌作用机理,本研究利用快速蛋白液相色谱技术(FPLC)结合抑菌活性测定,对NCD-2菌株的脂肽类抑菌物质进行分离、纯化,经质谱鉴定,该抑菌物质为芬荠素(fengycin)。从NCD-2菌株中克隆出fengycin合成酶基因fenC及其上游启动子序列,通过同源重组技术对fenC基因进行了内缺失突变,同NCD-2野生型菌株相比,fenC基因缺失突变子丧失了fengycin的合成能力,同时该突变子显著降低了对番茄灰霉病菌的拮抗活性。进一步在离体叶片上比较了NCD-2野生型菌株和突变子之间脂肽提取物和菌体细胞对番茄灰霉病的保护作用,结果发现,突变子不论是脂肽提取物还是菌体细胞显著降低了对番茄灰霉病的防治作用。     

Resistance of Malus domestica fruit to Botrytis cinerea depends on endogenous ethylene biosynthesis

The plant hormone ethylene regulates fruit ripening, other developmental processes, and a subset of defense responses. Here, we show that 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase (ACS)-silenced apple (Malus domestica) fruit that express a sense construct of ACS were more susceptible to Botrytis cinerea than untransformed apple, demonstrating that ethylene strengthens fruit resistance to B. cinerea infection. Because ethylene response factors (ERFs) are known to contribute to resistance against B. cinerea via the ethylene-signaling pathway, we cloned four ERF cDNAs from fruit of M. domestica: MdERF3, -4, -5, and -6. Expression of all four MdERF mRNAs was ethylene dependent and induced by wounding or by B. cinerea infection. B. cinerea infection suppressed rapid induction of wound-related MdERF expression. MdERF3 was the only mRNA induced by wounding and B. cinerea infection in ACS-suppressed apple fruit, although its induction was reduced compared with wild-type apple. Promoter regions of all four MdERF genes were cloned and putative cis-elements were identified in each promoter. Transient expression of MdERF3 in tobacco increased expression of the GCC-box containing gene chitinase 48.     

含肟酯的吡唑衍生物的合成及其抑菌活性

为发现高抑菌活性的先导化合物,结合本课题组前期研究,设计并合成了17个新型含肟酯的吡唑衍生物,结构经1H NMR、13C NMR及高分辨质谱分析确证,化合物7q的结构经单晶衍射确证.抑菌活性测定结果表明,目标化合物在50μg/mL下对苹果树腐烂病菌Valsa mali、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerot...     

绿针假单胞菌YL-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析

绿针假单胞菌YL-1对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用。采用转座子插入突变技术电转化绿针假单胞菌YL-1,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对3种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌Burkholderia glumae、解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora和胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovora抑菌效果显著下降的突变体,并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到YL-1染色体基因组上。利用质粒拯救技术克隆转座子插入位点基因、测序和生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌YL-1随机插入突变体库,筛选出7株对3种病原细菌抑制效果明显下降的突变体,但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株YL-1相同;PCR和Southern Blot试验结果表明绿针假单胞菌YL-1的7株突变体均是单拷贝;克隆到7个突变体插入位点的基因序列并测序,生物信息学分析结果表明其中6个突变位点是嗜铁素合成基因簇,1个突变位点是蛋白分泌基因sec Y。     

地衣芽孢杆菌WIO发酵产生抗茵蛋白的研究

地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisW10是1株生防细菌,其能产生抗菌蛋白,对多种植物病原菌有较好的抑制效果。本试验研究了菌株W10产生抗菌蛋白的发酵条件,为工厂化生产工艺提供技术支持。试验结果表明,接种菌龄12h,2％接种量,发酵液pH7．0,发酵培养60h是菌株W10产生抗菌蛋白的适宜发酵条件。控制发酵温度有利于抗菌蛋白积累,第一段温度为30℃培养20h,第二段温度为28℃至发酵结束。最佳溶氧量为20％。2次补料发酵效果要高于分批发酵,补料为500mL含10g．L-1葡萄糖和5g·L-1蛋白胨的培养基;选用200mg·L-1聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚（GPE消泡剂,泡敌）为消泡剂。利用优化的控制条件发酵培养菌株W10,与优化前相比,对目标病菌的抑菌率增加了34．6％。     

5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯衍生物的合成及抑菌活性

异噁唑是具有较好活性的五元杂环,本文设计并合成了15个5-甲基异噁唑-4-甲酸肟酯类新化合物,利用核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱对其结构进行确证,并测试了其对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、苹果树腐烂病菌Valsa mali和小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis的离体抑菌活性。结果表明,在50μg/mL下,目标化合物对供试病原菌均有一定的抑菌活性,其中化合物5g对番茄灰霉病菌的抑制活性优于先导化合物L1和肟菌酯,EC₅₀值为1.95μg/mL。     

萎缩芽胞杆菌HMB22922发酵工艺及其制剂研制

萎缩芽胞杆菌Bacillus atrophaeus HMB22922是一株有效防治棉铃疫病的生防细菌。为降低该菌株的生产成本和提高其制剂的适用性,本研究完善了该菌株的发酵工艺并筛选出用于可湿性粉剂加工的适宜助剂。通过对11种规模化生产所用培养基进行筛选,确定2号培养基作为初始培养基;采用正交试验设计对其进行优化,结果表明,黄豆粉、酵母粉、玉米粉及碳酸钙是影响该菌株发酵活菌数的主效因素,最佳用量分别为13、3、30和3 g/L。进一步确定发酵液初始pH值为7.0、培养温度30℃为该菌株的适宜培养条件,发酵活菌数达到2.81×10⁹ cfu/mL。分别以润湿时间和悬浮率为指标,筛选该菌株可湿性粉剂所需助剂,结果表明,采用粉状885增效助剂B型和SP-2836作为润湿剂和分散剂,其可湿性粉剂润湿分散性能最优,并确定2.00×10⁹ cfu/g萎缩芽胞杆菌HMB22922可湿性粉剂配方。该制剂防治棉铃疫病的室内评价结果表明,人工接种棉铃疫病病原菌7 d后,该制剂能显著降低棉铃疫病的病情指数,防效达52.16%。