草莓镶脉病毒ORF Ⅱ基因的克隆、原核表达与抗血清制备

 用CTAB法从感染草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus, SVBV）的草莓叶片中提取总DNA,设计特异性引物扩增SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因,克隆并测序。结果表明,SVBV中国分离物ORF Ⅱ基因全长486 nts,编码161个氨基酸。将其与SVBV美国分离物以及花椰菜花叶病毒属其他成员的ORF Ⅱ基因相比较,结果表明,SVBV中国分离物 ORF Ⅱ基因与SVBV美国分离物的核苷酸序列相似性最高,达91.2%。将SVBV ORF Ⅱ基因插入原核表达载体pET32a（+）,重组质粒pET-ORF Ⅱ转化大肠杆菌BL21（DE3）。经IPTG诱导及Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为38 kDa的融合蛋白。以此纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,可以制备出高效价的抗血清。Western blot分析表明,制备的抗血清能与重组融合蛋白发生特异性反应。利用抗血清进行ELISA测定,能够检测出感病草莓植株病汁液中SVBV ORF Ⅱ基因表达的蛋白。     

草莓镶脉病毒ORF Ⅵ基因的原核表达与抗血清制备

为了分析草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）ORF Ⅵ基因的功能,采用原核表达技术获得该基因表达的重组蛋白并制备其抗血清。利用PCR技术扩增得到SVBV中国分离物的ORF Ⅵ基因,将此基因克隆到原核表达载体pET-SUMO上,获得重组质粒pET-SUMO-ORF Ⅵ。转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导与Ni²⁺-NTA亲和柱纯化,获得分子质量约为90 kD的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清,采用间接ELISA和Western blot方法测定抗血清的效价、反应灵敏度以及ORF Ⅵ基因在本氏烟中的瞬时表达。结果显示,间接ELISA法测定抗血清对重组蛋白的效价达1：256 000,Western blot法能够检测到稀释64 000倍的重组蛋白。利用稀释2 000倍的抗血清,仍能够检测出SVBV中国分离物和美国分离物ORF Ⅵ基因在本氏烟中瞬时表达的蛋白。     

芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及P3蛋白抗血清的制备

 用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒( Turnip mosaic virus,TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%~99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%~99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。     

甘蔗花叶病毒HC-Pro基因原核表达及表达产物抗血清制备

采用RT-PCR方法自甘蔗花叶病毒北京玉米分离物（SCMV-BJ）的基因组中分离出其HC-Pro基因，通过T4DNA聚合酶连接到原核表达载体pET-22b（＋）上，获得的重组子pETHC转化大肠杆菌B121（DE3），用IPTG在37℃进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明，HC-Pro基因在大肠杆菌中获得了高效表达，产生分子量约为52kDa的融合蛋白。将融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性的抗血清并提取了抗体IgG。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1／8192。结果表明，该血清可用于SCMV-BJ的检测，并为进一步分析HC-Pro的功能奠定基础。     

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S7片段的克隆及其S7-1基因编码蛋白的原核表达

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克隆到原核表达载体p ET-GST上,重组质粒p ET-S7-1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导及Ni~(2+)-NTA亲和柱纯化融合蛋白,再进行Western blot检测。结果显示,SRBSDV安徽分离物S7片段与其它SRBSDV各个分离物S7片段的序列相似性极高,达99.3%~99.9%,而与斐济病毒属Fijivirus其它种之间的序列相似性较低,为35.5%~73.3%。SRBSDV安徽分离物与其它SRBSDV各个分离物聚成1个单独的分支,彼此间亲缘关系较近。试验获得了分子质量约为68 k D的S7-1融合蛋白,且GST单抗能够与S7-1融合蛋白发生特异性反应,表明本研究得到的融合蛋白确为靶标蛋白。     

南瓜蚜传黄化病毒湖北和云南分离物的部分序列分析

 本研究从带有黄化症状的南瓜叶片中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增得到来自湖北和云南的南瓜蚜传黄化病毒(CABYV)2个分离物的1375nt特异性核苷酸片段。分别将PCR产物插入到克隆载体pMD19-T并转化大肠杆菌DH5α,对筛选到的阳性克隆进行了序列测定和分析(GenBank登录号为EF488996和EF488997)。所获片段含有部分复制酶基因576nt,非编码区199nt和完整的CP基因600nt,编码一个由199个氨基酸组成的分子量约为22kDa的结构蛋白。湖北和云南分离物与法国分离物、意大利分离物、西班牙分离物、北京分离物和上海分离物的CP基因核苷酸序列和推测氨基酸序列的同源性分别为93.1%~98.5%和91.4%~98.5%。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 采用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物(Cucumber green mottle mosaic virus Liaoning isolate, CGMMV-LN)的cp基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b (+)上, 将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b (+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和W estern blot分析表明, cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达, 融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔, 制备了CGMMV特异性抗血清, 抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20 000。     

烟草曲茎病毒AC4基因的原核表达与免疫定位

 利用PCR方法从烟草曲茎病毒(TbCSV) Y3 5分离物的病株中获得AC4基因,将其克隆到原核表达载体pET-30a上获得重组质粒pET-Y35AC4,重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中,IPTG诱导后SDS-PAGE发现,AC4蛋白已在大肠杆菌中获得了表达。利用Ni²⁺-NTA亲和树脂纯化了AC4重组蛋白,免疫家兔获得AC4蛋白的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术对感病烟草中AC4蛋白进行定位发现,TbCSV AC4蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。     

水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗体制备

为探讨水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）的种群变异,采用RT-PCR方法从感染RBSDV山东分离物RBSDV-JN1的水稻中克隆该病毒的S10片段,并进行序列分析,进而构建包含RBSDV-JN1的CP基因的原核表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达;并以表达的融合蛋白为抗原,制备病毒的多克隆抗体。结果显示：S10片段全长为1 801 bp,包含1个1 677 bp编码框,编码558个氨基酸的外壳蛋白（CP）;与GenBank已注册的19个RBSDV的CP基因序列相比较发现,病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为90.5%~99.8%,氨基酸的序列相似性为95.9%~100.0%;地理位置较近的分离物间序列相似性较高,RBSDV种群分布呈现区域性差异。原核表达载体pET-RBSDV-CP经IPTG诱导,获得了分子量约为63 kD带有His标签的目的蛋白。用该蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、Western blot和Dot-blot ELISA检测显示,效价为1：81 000,且具有良好的特异性。     

水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测

 The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni²⁺-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody.     

应用PCR方法检测烟粉虱传双生病毒

番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒,根据其外壳蛋白基因保守序列设计简并引物,对杭州和海宁地区番茄上疑似番茄黄化曲叶病毒进行PCR检测,获得产物克隆到pMD18-T载体中,经测序和序列分析,表明杭州和海宁地区发生的病毒是番茄黄化曲叶病毒,并且两地区病毒核苷酸序列同源性达97.5%。     

江苏菜豆上分离的番茄黄化曲叶病毒基因组序列分析

 2012年,江苏南京菜豆上出现了一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片皱缩、植株矮化等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行了研究,结果从中检测到一种粉虱传双生病毒,对其基因组DNA-A组分克隆测序后发现其全长2 781 bp,编码6个ORF,BLAST及聚类分析结果显示该病毒与番茄黄化曲叶病毒同源性最高(99%),是番茄黄化曲叶病毒的一个分离物。这是江苏省番茄黄化曲叶病毒侵染菜豆的首次报道,暗示番茄黄化曲叶病毒可能是我国菜豆种植的重要潜在威胁。     

北京地区番茄黄化曲叶病病毒分离物测定及株系的初步鉴定

 番茄黄化曲叶病毒病是番茄生产中的一种毁灭性病毒病害,2009年传入北京。利用烟粉虱传双生病毒简并引物PA/PB对2010年~2011年采集自北京市5个区县的53个番茄样品进行检测,30个表现典型黄化曲叶病症状的样品均扩增得到约500 bp的特异条带,测定了其中7个样品的部分序列,经序列比对分析表明其为番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）。利用TYLCV特异引物TJ-F/TJ-R、TY-F/TY-R对样品BJDXXY、BJFS02、BJFS03、BJMY2231进行TYLCV基因组克隆和序列测定,经分析4个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781碱基,编码6个蛋白。基因组序列比较发现,这4个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到98%以上;通过建立系统发育树,发现BJDXXY、BJFS02、BJFS03与河北分离物（HBLF4）、山东分离物（SDSG）亲缘关系较近,BJMY2231与上海分离物（TYLCV-Israel）、江苏分离物（JSNJ1）亲缘关系较近。     

广东省番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析

番茄黄化曲叶病毒病是世界番茄生产上一种毁灭性病害,番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)是引起该病害的主要病原病毒之一。本文采用滚环扩增及基因克隆方法,获得了侵染广东佛山和肇庆番茄的TYLCV 4个分离物全基因组;它们均为2 781 nt,编码6个ORF,其中病毒链上编码AV1和AV2,互补链上编码AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比较结果表明,4个广东分离物基因组序列两两间同源性为99%以上;与已报道的TYLCV各分离物同源性在90%以上,而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在98%以上。系统进化分析显示,广东分离物与来自中国不同地区的TYLCV分离物亲缘关系较近,并聚类在一个分支。因此,侵染引起广东佛山和肇庆番茄黄化曲叶病的病毒应来自国内其他地区。本研究是对TYLCV广东分离物分子特征的首次报道。     

基于Real-time PCR监测番茄黄化曲叶病毒在番茄植株中的动态变化

 本研究根据番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)分离物-SH2基因组序列,设计了一对引物,以番茄25S rRNA基因为内参,建立了番茄黄化曲叶病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法可检测到浓度为4.64×10^-7 ng/μL的植物DNA中含有TYLCV,其灵敏度是常规PCR的1 000倍。利用该方法,研究了温室条件下以侵染性克隆接种TYLCV后的番茄植株中病毒DNA含量的变化情况。根、茎、叶中病毒DNA定量检测结果表明,TYLCV在3种植物器官中都呈现一个上升、稳定和下降的变化规律;病毒DNA在植株根部最早累积,累积的速度较慢,在叶部和茎部累积较快;叶部和茎部接种18 d后病毒DNA含量达到稳定期;在不同的器官中,病毒的含量不同,在茎部的含量最高,接种33 d后茎部病毒DNA的含量约为根部的100倍。本研究通过对TYLCV含量的动态监测,明确了病毒DNA在番茄植株中的累积和变化规律,为研究TYLCV侵染机制、病毒与寄主互作及病害防治提供了理论依据。     

河北省番茄黄化曲叶病毒病的分子鉴定初报

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链病毒,目前双生病毒病害已在多个国家和地区的作物上造成严重危害。近年来,我国多省报道作物上有这类病毒的发生,且有逐年加重和扩散的趋势。根据危害番茄的双生病毒DNA A序列保守区设计简并引物,对2009年4月采自河北省魏县表现叶片黄化、曲叶症状的4个番茄样品进行PCR检测,均为双生病毒阳性,对样品的扩增片断进行了克隆测序,经序列比对分析,与番茄黄化曲叶病毒（Tomato leaf curl virus,TYLCV）山东分离物（FJ646611.1）序列相似性为99.25%~99.55%,说明河北番茄黄化曲叶病由TYLCV引起。     

侵染广西番茄的番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定

番茄黄化曲叶病毒病是番茄生产上的毁灭性病害,严重影响番茄产量及品质。2019年从广西百色市采集疑似番茄黄化曲叶病叶片样品,采用滚环扩增(RCA)及基因克隆等方法,获得了4个烟粉虱传双生病毒的全基因序列,4个分离物的全长序列分别为2 776、2 781、2 752、2 781 bp,均编码6个开放阅读框;核苷酸相似性比较发现,4个分离物彼此间的相似性均在90%以上,与已报道的番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)各分离物间的相似性也在91%以上;系统进化分析表明,TYLCV广西分离物BS-2和BS-4与TYLCV-Hunan、BS-1和BS-3与TYLCV-YN6553等分离物处于独立的小分支,说明TYLCV广西分离物与TYLCV-Hunan、TYLCV-YN6553具有较近的亲缘关系。本研究首次报道TYLCV在广西发生。     

广西部分烟区烟草曲叶病病原的分子鉴定

[目的]明确广西西部地区靖西(JX)、凌云(LY)、德保(DB)和乐业(LeY)等4个县市烟草曲叶病的病原。[方法]2010年5-6月分别从广西靖西、凌云、德保和乐业等县市采集具有典型曲叶症状的烟草叶片,用基于双生病毒DNA保守序列设计简并引物Bego-1和Bego-6对病叶组织总DNA抽提物进行PCR扩增和对PCR产物进行序列测定,用BLAST、Vector NTI、MEGA 4.0和Simplot program 3.2软件等进行病毒序列分析、系统进化树构建和病毒重组分析。[结果]从选取的9个表现典型曲叶症状的样品叶组织总DNA抽提物中均可扩增出约1500bp与预期大小相符的DNA片段。测序和序列比对分析显示,9个样品扩增产物核苷酸序列相似性为73.7%～99.2%,与已报道的双生病毒具较高的相似性。其中,JX-2与中国番茄曲叶病毒广西番茄分离物(G32)的相似性最高,达99.2%;JX-3和JX-5与云南胡椒曲叶病毒云南辣椒分离物(YN323)相似性最高,分别为92.5%和93.4%;LeY-1、LY-1、DB-1、JX-1、JX-4和JX-6则与中国番茄黄化曲叶病毒中国番茄分离物(CHI)和广西烟草分离物(G102)的相似性最高,均高于95.0%。基于PCR扩增产物及已报道的双生病毒属代表种相应核苷酸序列构建的系统进化树分析表明,9个广西烟草分离物分属3个簇群:中国番茄曲叶病毒簇、云南辣椒曲叶病毒簇和中国番茄黄化曲叶病毒簇。重组分析结果表明:JX-3是云南辣椒曲叶病毒和中国番茄曲叶病毒的重组病毒,JX-5是云南辣椒曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒的重组病毒。[结论]9个广西烟草分离物分属于4种双生病毒:中国番茄曲叶病毒和中国番茄黄化曲叶病毒,以及分别由上述两种病毒与云南辣椒曲叶病毒重组而来的2种重组病毒。其中,中国番茄曲叶病毒自然侵染烟草、云南辣椒曲叶病毒和中国番茄曲叶病毒及中国番茄黄化曲叶病毒的重组病毒等结果此前均未见报道。