一种复方中草药制剂对黄颡鱼非特异性免疫机能和抗病力的增强作用

根据供试黄颡鱼的鱼体质量添加中草药制剂剂量(0～1 000mg/kg)的不同,试验设6个组(对照、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ),连续投喂30d后,测定黄颡鱼血液中白细胞的吞噬活性、血清中溶菌酶和补体活性;另采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)注射的方法进行人工攻毒,进行抗病力检测。结果表明,各供试组黄颡鱼血液中白细胞的吞噬活性均显著高于对照组。第Ⅰ组黄颡鱼血清中溶菌酶的活性与对照组之间没有显著性差异,而试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组和Ⅴ组黄颡鱼血清中溶菌酶的活性均显著高于对照组。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ组黄颡鱼血清中补体活性与对照组之间存在显著差异,而第Ⅰ组与对照组之间无显著性差异。活菌攻毒的方式证明投喂复方中草药制剂能增强黄颡鱼对人工感染A.hydrophila活菌的抵抗力。从增强非特异性免疫机能与抗病力的效果考量,这种复方中草药制剂在黄颡鱼饵料中添加量以400～800mg/kg为宜。     

中草药添加剂对黄颡鱼繁殖性能及效果的影响

于2006年4月至7月,在7个池塘中放养3冬龄黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco亲鱼,分别给雌、雄鱼投喂添加枸杞、女贞子等和淫羊霍、杜仲等中草药的饲料。结果表明：摄食添加中草药饲料的雌鱼性腺指数（26．00％-26．17％）、受精率（80．10％-87．50％）和每尾亲鱼的出苗率（2683—4965尾）显著高于对照组（15．30％-19．55％、63．56％～77．42％和2413—2870尾）;雌亲鱼性腺和肌肉中n-3系列不饱和脂肪酸的含量显著高于对照组,n-6系列显著低于对照组;粗蛋白含量显著低于对照组,脂肪含量显著高于对照组（P〈0．05）;雌亲鱼血液中雌二醇含量显著低于对照组,雄鱼血液中睾酮含量极显著低于对照组（P〈0．01）。文中还讨论了中草药促进性腺发育成熟,提高繁殖效率的机理。     

黄颡鱼仔稚鱼发育过程中的胰蛋白酶原基因表达

采用RT-PCR和实时荧光定量PCR方法,得到黄颡鱼(Pelteobagrusf ulvidraco)消化系统胰蛋白酶原基因cDNA,并且对其早期发育过程中仔稚鱼(1～3日龄)消化系统胰蛋白酶原基因表达进行检测和定量。结果表明,黄颡鱼消化系统中胰蛋白酶原的基因表达起始于1日龄,1～6日龄表达量快速增加、6～23日龄表达量呈起伏式增加、23～30日龄表达量显著增加。该结果同时表明使用实时荧光定量PCR的方法检测黄颡鱼胰蛋白酶原基因的表达量,能反映其肠道消化功能在发育过程中的变化。建议黄颡鱼仔稚鱼转饵时间在23日龄后。     

黄颡鱼胰岛素样生长因子结合蛋白1基因的克隆及表达分析

为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基因核苷酸序列与鲇形目斑点叉尾鮰的相似度(89%)较高,与鲢、鲤、鲫、草鱼和团头鲂等的差异较大;肝脏是黄颡鱼IGFBP1基因m RNA表达最丰富的组织,IGFBP1基因在雄性个体心脏、肾脏、肌肉和肠组织中的表达量显著高于雌性的(P0.05);IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉组织中都有表达,且在雄性个体中的表达量高于在雌性个体中的表达量。     

饥饿对黄颡鱼血液中几种免疫相关因子的影响

对黄颡鱼分别饥饿0(对照)、6、12、18、24、30 d后再恢复投喂18 d,测定了饥饿时和恢复投喂后各组黄颡鱼血液中具有吞噬能力的免疫细胞数、血清中溶菌酶活力、溶血素含量以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果表明:黄颡鱼经短期饥饿(6 d),其血液中具有吞噬能力的免疫细胞数和血清中溶菌酶的活力较对照组略有增加,其它2种指标略有下降,但差异均不显著(P>0.05);延长饥饿时间后,其它4组鱼免疫细胞的吞噬能力、溶菌酶活力(饥饿12 d组除外)及溶血素含量显著下降(P<0.05),而血清中SOD的活性在饥饿时间<18 d内没有显著变化(P>0.05)。恢复投喂18 d后,以上4种指标都明显上升,且饥饿时间为6、12、18 d 3组鱼可以或基本恢复至对照组的水平;饥饿超过24 d,黄颡鱼的4种指标不能完全恢复,说明黄颡鱼饥饿一定时间后,其免疫机能明显受到了影响。     

黄颡鱼饲料中适宜的蛋白质含量和能量蛋白比

采用3×3因子试验法设计了3种不同蛋白质水平(36%、37 5%、39%)及能量蛋白比水平(37、38、39kJ/g蛋白)的9种试验饲料,以体重为(11 65±0 85)g的黄颡鱼PseudobagrusfulvidracoR 为养殖对象,在水温为(24 0±0 5)℃的室内恒温循环水养殖系统中进行为期68d的生长试验。结果表明,饲料中蛋白质含量与能量蛋白比对黄颡鱼的生长和消化率的影响显著,其中以8号饲料(蛋白质39 13%,能量蛋白比38 23kJ/g蛋白)的养殖效果和饲料干物质的消化率为最好。对饲料中蛋白质含量、能量蛋白比与增重率、饲料系数、特定生长率、蛋白质效率、饲料干物质的表观消化率、脂肪的表观消化率指标进行回归分析,结果表明,黄颡鱼人工配合饲料中适宜的蛋白质含量为37 58%～39 02%,适宜的能量蛋白比(C/P)为38 29～39 23kJ/g蛋白。     

黄颡鱼鳍组织培养及染色体制备条件的研究

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco幼鱼鱼鳍为组织来源,采用组织块培养法,对其短期培养及染色体制片所需的消毒方法、培养基、培养温度、秋水仙素浓度和低渗处理时间等条件进行了探索,初步建立了以鳍组织培养法提供材料制作黄颡鱼染色体标本的方法。     

黄颡鱼朗格汉斯细胞的鉴定及其功能基因的表达分析

为研究黄颡鱼朗格汉斯细胞的结构特点以及细菌感染对其功能相关基因表达的影响,采用免疫组化技术对黄颡鱼免疫器官中朗格汉斯细胞进行鉴定,通过透射电镜进一步观察到黄颡鱼朗格汉斯细胞的超微结构,并采用荧光定量PCR检测鲶爱德华氏菌感染后黄颡鱼免疫相关组织内朗格汉斯细胞功能相关基因IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4的表达情况。结果显示,黄颡鱼头肾和脾脏中具有朗格汉斯细胞的特异性分子标记CD207蛋白,且黄颡鱼朗格汉斯细胞的结构与其他脊椎动物类似,即细胞质中大量的伯贝克颗粒围绕着中心粒呈放射状排列。在鲶爱德华氏菌感染后,朗格汉斯细胞功能相关基因IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4在黄颡鱼免疫器官内的表达量显著上调。上述结果表明,黄颡鱼含有朗格汉斯细胞,并且其可能参与了机体抗鲶爱德华氏菌感染的免疫反应。     

黄颡鱼鳍组织培养及染色体制备条件的研究

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco幼鱼鱼鳍为组织来源,采用组织块培养法,对其短期培养及染色体制片所需的消毒方法、培养基、培养温度、秋水仙素浓度和低渗处理时间等条件进行了探索,初步建立了以鳍组织培养法提供材料制作黄颡鱼染色体标本的方法。     

鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco “红头病”病原---鮰爱德华菌 Edwardsiella ictaluri A86为抗原,利用杂交瘤技术制备了鮰爱德华菌黄颡鱼分离株的菌体单抗5D11、1B8、1G7、3G8、5A9、3H8,其效价分别为1：1280、1：1280、1：2560、1：320、1：160和1：80。结果表明：6株单抗与11株鮰爱德华菌黄颡鱼分离株均可以结合,与迟缓爱德华菌、气单胞菌、大肠杆菌、链球菌、弧菌等10株参考菌株均无交叉反应,单抗5D11和1B8可与鮰爱德华菌参考菌株结合。应用免疫荧光和免疫组织化学法检测了鮰爱德华菌对黄颡鱼的侵染规律。结果表明：黄颡鱼经人工注射鮰爱德华菌A86感染6 h后,在其肝、肾、脾、心、肠和胃中检测到了阳性细菌,其中脾脏中最多,心脏中最少;感染24 h后,脑中检测到阳性细菌;30 h后,鳃中显示有阳性信号;54 h后,在眼的外边缘检测到少量阳性细菌。研究结果可为进一步研究鮰爱德华菌在黄颡鱼体内的致病机理提供技术手段及基础,对揭示黄颡鱼“红头病”的发病机制具有重要意义。     

鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco红头病病原——鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri A86为抗原,利用杂交瘤技术制备了鮰爱德华菌黄颡鱼分离株的菌体单抗5D11、1B8、1G7、3G8、5A9、3H8,其效价分别为1∶1280、1∶1280、1∶2560、1∶320、1∶160和1∶80。结果表明:6株单抗与11株鮰爱德华菌黄颡鱼分离株均可以结合,与迟缓爱德华菌、气单胞菌、大肠杆菌、链球菌、弧菌等10株参考菌株均无交叉反应,单抗5D11和1B8可与鮰爱德华菌参考菌株结合。应用免疫荧光和免疫组织化学法检测了鮰爱德华菌对黄颡鱼的侵染规律。结果表明:黄颡鱼经人工注射鮰爱德华菌A86感染6 h后,在其肝、肾、脾、心、肠和胃中检测到了阳性细菌,其中脾脏中最多,心脏中最少;感染24 h后,脑中检测到阳性细菌;30 h后,鳃中显示有阳性信号;54 h后,在眼的外边缘检测到少量阳性细菌。研究结果可为进一步研究鮰爱德华菌在黄颡鱼体内的致病机理提供技术手段及基础,对揭示黄颡鱼红头病的发病机制具有重要意义。     

三角帆蚌钩介幼虫寄生胁迫对黄颡鱼营养指标的影响

为探索三角帆蚌Hyriopsis cumingii钩介幼虫寄生对寄主鱼营养指标的影响,测定了三角帆蚌钩介幼虫寄生胁迫对不同寄生阶段黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco血浆、肝脏和肌肉组织中糖原、游离脂肪酸、总蛋白、游离氨基酸含量的变化情况。结果表明:在相同时间点,寄生组与对照组鱼肝脏和肌肉中糖原含量均无显著性差异(P0.05);寄生组鱼肝脏中游离脂肪酸含量在寄生后期(12 d)显著低于对照组(P0.05),在寄生前期(2 d)、中期(5 d)与对照组无显著性差异(P0.05),寄生组鱼血浆、肌肉游离脂肪酸含量与对照组无显著性差异(P0.05);寄生组、对照组鱼在寄生中期和后期肝脏总蛋白含量均显著降低(P0.05),血浆、肌肉总蛋白含量无显著性变化(P0.05);寄生组鱼血浆游离氨基酸含量在寄生中期和后期显著低于对照组(P0.05),寄生组鱼肝脏游离氨基酸在寄生后期显著低于对照组(P0.05),寄生前期、中期与对照组无显著性差异(P0.05)。研究表明,钩介幼虫寄生会导致肝脏游离脂肪酸降低,血浆及肝脏游离氨基酸含量下降,推测脂肪酸和游离氨基酸可能是钩介幼虫变态发育的关键营养因子。     

三角帆蚌钩介幼虫寄生胁迫对黄颡鱼营养指标的影响

为探索三角帆蚌Hyriopsis cumingii钩介幼虫寄生对寄主鱼营养指标的影响,测定了三角帆蚌钩介幼虫寄生胁迫对不同寄生阶段黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco血浆、肝脏和肌肉组织中糖原、游离脂肪酸、总蛋白、游离氨基酸含量的变化情况。结果表明:在相同时间点,寄生组与对照组鱼肝脏和肌肉中糖原含量均无显著性差异(P>0.05);寄生组鱼肝脏中游离脂肪酸含量在寄生后期(12 d)显著低于对照组(P<0.05),在寄生前期(2 d)、中期(5 d)与对照组无显著性差异(P>0.05),寄生组鱼血浆、肌肉游离脂肪酸含量与对照组无显著性差异(P>0.05);寄生组、对照组鱼在寄生中期和后期肝脏总蛋白含量均显著降低(P<0.05),血浆、肌肉总蛋白含量无显著性变化(P>0.05);寄生组鱼血浆游离氨基酸含量在寄生中期和后期显著低于对照组(P<0.05),寄生组鱼肝脏游离氨基酸在寄生后期显著低于对照组(P<0.05),寄生前期、中期与对照组无显著性差异(P>0.05)。研究表明,钩介幼虫寄生会导致肝脏游离脂肪酸降低,血浆及肝脏游离氨基酸含量下降,推测脂肪酸和游离氨基酸可能是钩介幼虫变态发育的关键营养因子。     

Artificial induction of androgenetic diploid in Yellow catfish （Pelteobagrus fulvidraco）

Androgenesis was the especial zoogamy that the germ plasma of offspring was from the agnate.In this study the eggs of Yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco)were irradiated by UV suspending in the synthetic ovarian fluid(OF),and the total dosage of UV irradiation was 220 mJ·cm~(-2).Diploid could be induced by heat shock(40℃,2 min,3 min)with different time period after fertilization(15-37 min).The result showed that heat shock with 2 min was better than 3 min;there were two apices of induction in 17-21 min and 27-31 min after fertilization.The highest hatching rate was 3.30% at 29 min after fertilization,and the difference between two apices of induction was unobvious.     

饲料中不同叶酸、维生素B_(12)水平对黄颡鱼生长及免疫力的影响

为研究饲料中不同叶酸、维生素B_(12)(VB_(12))水平对黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco生长及免疫力的影响,以900尾体质量为(31. 84±0. 05) g的健康黄颡鱼为试验对象,将其随机分为10组,每组设3个重复,以叶酸(0. 15%、0. 30%、0. 45%)、VB_(12)(0. 05%、0. 10%、0. 15%)为影响因素,采用双因素试验设计中的3×3因子设计法,配制9种饲料,以不添加叶酸和VB_(12)的饲料作为对照组,用10种饲料饲喂试验鱼56 d后,测定其对黄颡鱼生长及免疫相关指标的影响。结果表明:在一因素水平固定的情况下,黄颡鱼终末体质量、增重率和特定生长率均随另一因素水平的增加而增加,饲料系数呈降低趋势;在叶酸/VB_(12)水平为0. 45%/0. 15%时,黄颡鱼终末体质量、增重率、特定生长率均最高且显著高于对照组(P<0. 05),饲料系数显著低于对照组(P<0. 05);在叶酸/VB_(12)水平为0. 45%/0. 15%时,血清及肝脏中补体C3、补体C4含量最高,NO含量、NOS活性最高且显著高于对照组(P<0. 05)。研究表明,在本试验条件下,适量添加叶酸和VB_(12)可有效促进黄颡鱼生长,增强其免疫力,综合黄颡鱼生长、免疫力和饲料成本分析,建议饲料中叶酸/VB_(12)添加水平为0. 45%/0. 10%。     

黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体

为研究促性腺激素释放激素受体 ( gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR) 对黄颡鱼Pel-teobagrus fulvidraco性别分化和性腺发育的调控作用, 采用逆转录PCR、氨基酸序列多重比对、系统进化树分析及实时定量PCR方法, 对黄颡鱼GnRHR基因的序列、表达和进化进行了研究.结果表明: 扩增到的黄颡鱼GnRHR cDNA序列长2 894 bp, 包含239 bp的5′非翻译区, 1 155 bp的开放阅读框和1 500 bp的3′非翻译区, 预测编码384个氨基酸、 7次跨膜结构域蛋白; 氨基酸序列多重比对显示, 黄颡鱼GnRHR与硬骨鱼类GnRHR的同源性较高, 其与斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、斑马鱼Danio rerio、鲤Cyprinus carpio、银鲫Carassius auratus GnRHR氨基酸序列的一致性分别为96%、 87%、 83%和82%, 与哺乳动物的一致性较低, 为42%～44%; 系统进化分析显示, 黄颡鱼GnRHR与鲤、虹鳟等硬骨鱼类的GnRHR聚为GnRHRⅡB分支; 实时定量PCR显示, 黄颡鱼GnRHR mRNA主要在端脑、中脑、下丘脑、垂体和精巢中高表达,但在卵巢和其他组织中几乎不表达; 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建和筛选出了黄颡鱼GnRHR突变体, 成功获得了各种不同的黄颡鱼GnRHR F0代突变体.研究表明, GnRHR可能参与调控黄颡鱼雄性发育, 黄颡鱼GnRHR F0代突变体的获取为探索GnRHR的功能和机制提供了基础资料.     

黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体

为研究促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)对黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco性别分化和性腺发育的调控作用,采用逆转录PCR、氨基酸序列多重比对、系统进化树分析及实时定量PCR方法,对黄颡鱼GnRHR基因的序列、表达和进化进行了研究。结果表明:扩增到的黄颡鱼GnRHR cDNA序列长2 894 bp,包含239 bp的5′非翻译区,1 155 bp的开放阅读框和1 500 bp的3′非翻译区,预测编码384个氨基酸、7次跨膜结构域蛋白;氨基酸序列多重比对显示,黄颡鱼GnRHR与硬骨鱼类GnRHR的同源性较高,其与斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、斑马鱼Danio rerio、鲤Cyprinus carpio、银鲫Carassius auratus GnRHR氨基酸序列的一致性分别为96%、87%、83%和82%,与哺乳动物的一致性较低,为42%～44%;系统进化分析显示,黄颡鱼GnRHR与鲤、虹鳟等硬骨鱼类的GnRHR聚为GnRHRⅡB分支;实时定量PCR显示,黄颡鱼GnRHR mRNA主要在端脑、中脑、下丘脑、垂体和精巢中高表达,但在卵巢和其他组织中几乎不表达;通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建和筛选出了黄颡鱼GnRHR突变体,成功获得了各种不同的黄颡鱼GnRHR F0代突变体。研究表明,GnRHR可能参与调控黄颡鱼雄性发育,黄颡鱼GnRHR F0代突变体的获取为探索GnRHR的功能和机制提供了基础资料。     

促乳中草药对泌乳大鼠免疫功能的影响

选用分娩当日泌乳母鼠96只,分成4组,每组24只。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别在对照组基础上添加1%中草药(分别为王不留行、黄芪、益母草)。母鼠分娩后当日将每窝仔鼠一律调整为8只。在3、11、22日龄屠宰母鼠取血清测定各免疫指标。结果表明,与对照组相比,黄芪能显著提高泌乳后期母鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)水平和泌乳后期母鼠脾脏淋巴细胞转化率(P<0.05),益母草能显著提高泌乳后期母鼠脾脏淋巴细胞转化率(P<0.05)。泌乳期内各组母鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)水平均差异不显著(P>0.05)。黄芪和益母草能增强泌乳大鼠的免疫功能。     

黄颡鱼性腺分化及温度对性别分化的影响

采用组织切片法研究黄颡鱼的性腺分化并观察温度对性别分化的影响。结果发现,(27±1)℃(中温组)条件下,15日龄(全长(13.99±0.24)mm)黄颡鱼性腺开始分化,具有裂隙(即卵巢腔)的原始性腺未来发育为卵巢,而不具裂隙的原始性腺未来发育为精巢;精小叶和输精管最早出现于60日龄(全长(47.58±1.74)mm),雌性生殖细胞的发育及分化显著早于雄性。(32±1)℃条件下(高温组)仔鱼性腺分化比中温组早5~10d,(22±1)℃(低温组)仔鱼发育缓慢,性腺分化比中温组晚25~30d。中温组和低温组幼鱼雌雄比接近1∶1(分别为1∶0.96和1∶1.17);高温组幼鱼雌雄比例为1∶2.09,雄性率为(67.70±0.54)%。高温条件((32±1)℃)使性腺发育趋向雄性。