反义CCoAOMT基因转化烟草调控木质素生物合成

通过农杆菌介导法将美洲黑杨CCoAOMT cDNA反向导入烟草,获得一批转基因抗性植株.经PCR检测,证明CCoAOMT基因已成功反义转入到烟草植株中.通过对转基因植株和对照植株木质素含量的对比分析,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度下降,下降最多的达9.2%.     

反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。     

转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株的获得及其抗旱性分析

根据前期克隆的火龙果过氧化氢酶基因(HuCAT)设计特异引物,从克隆载体PMD18T-HuCAT中扩增出特异带,将其连入植物表达载体pSH737,构建了CaMV35s启动子驱动的表达载体pSH737-HuCAT;采用农杆菌介导法转化烟草,获得37个抗性植株,经GUS组织化学染色及PCR扩增鉴定,有29个株系为转基因植株;经半定量RT-PCR及荧光定量PCR检测,筛选出高表达株系22个;以PEG-6000溶液模拟干旱胁迫条件,测定转基因烟草的抗旱相关生理指标,结果显示,转基因烟草CAT活性、SOD活性、POD活性、PRO含量和相对含水量均高于野生型烟草,MDA含量低于野生型烟草,表明转HuCAT基因可能提高了烟草的抗旱性.     

转BpCCR1正义链及反义链对7年生盆栽白桦木质素的影响及优良株系选择

目的肉桂酰辅酶还原酶（Cinnamoyl-CoA Reductase，CCR）是催化木质素合成特异途径中的第一个限速酶。通过测定转基因株系和野生型株系（WT）的木质素和单体含量，探究转BpCCR1基因正义链和反义链对白桦木质素含量的影响，进而筛选出转基因优良株系。方法以获得的7年生白桦转BpCCR1正、反义链株系为试验材料，采用PCR及qRT-PCR技术分别对目标基因的稳定性及表达量进行检测，采用改进的Klason法及液相色谱法分别对木质素含量及单体含量进行测定，采用硝酸－氯酸钾法和排水法分别对木纤维长和宽及基本密度进行测定，并调查树高及胸径，以此来分析转BpCCR1正、反义链对白桦上述性状的影响。结果PCR检测表明，5个转正义链株系及14个转反义链株系的目标基因均为阳性；qRT-PCR分析显示，BpCCR1基因不但在转正义链株系中上调表达，而且在转反义链株系中也呈上调表达。转正、反义链白桦株系木质素含量均增加，其中10个转反义链株系的Klason木质素和总木质素含量均值较野生型株系（WT）分别提高了7.46%和7.05%，木质素含量最高的FCR11株系较WT株系分别提高了12.26%和11.81%；转基因株系基本密度虽然有一定的变化，但无明显规律。转正义链株系的木纤维宽明显变小，5个株系均值较WT减少8.82%；而转反义链株系的木纤维长受到明显抑制，有11个株系与WT的差异达到了显著性水平（P < 0.05），其均值较WT减少12.12%。转基因株系与WT的材积差异也达到显著性水平，有11个转反义链株系的材积大于WT，7个株系达到显著性水平（P < 0.05），其平均材积生长量较WT提高77.1%。采用主成分分析法选择FCR2、FCR27和FCR33株系为优良株系。结论转BpCCR1正义链及反义链均提高白桦木质素含量，综合树高、胸径等6个性状筛选出3个优良转基因株系。      

烟草铁蛋白基因NtFer1对粳稻遗传转化及其基因功能研究

利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因Nt Fer1转入粳稻,经抗性筛选、PCR、Southern杂交、Northern杂交检测。结果表明,外源基因已整合到粳稻基因组中,并能稳定遗传表达。过量Fe2+营养液条件下培育自交T1代植株,研究表明转基因株系SOD和POD活性、叶绿素相对含量高于对照,而MDA含量则相反;转基因株系叶片和糙米总铁含量高于对照,所测16种氨基酸总含量与对照无显著差异,但部分氨基酸含量存在差异;接种稻瘟病混合小种菌液转基因株系稻瘟病叶瘟指数低于对照。烟草铁蛋白基因Nt Fer1转入表达可提高粳稻叶片和糙米储藏铁离子能力,增强对高铁胁迫耐性和稻瘟病叶瘟抗性。     

农杆菌介导BtCry1Ac、NTHK1双价基因转化烟草植株的研究

为探讨多基因植物转化载体p096899中外源基因BtCry1Ac和NTHK1在转基因植株中的表达情况,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化野生烟草,经卡那霉素筛选,初步获得了10株转基因烟草植株.经PCR鉴定,证明目的基因已被整合到烟草基因组中.利用荧光定量PCR和ELISA分析目的基因在转录水平和翻译水平的表达量,并对转基因烟草株系进行了抗虫试验和耐盐性试验.结果表明,目的基因在转录水平和翻译水平分别得到表达,但表达量存在差异,其中2号转基因株系毒蛋白表达量最高,其含量达可溶性总蛋白的0.028 5％;饲虫试验中,部分转基因烟草株系对斜纹夜蛾的毒杀作用明显高于未转化烟草,其中2号转基因株系的抗虫性最高,饲喂第6天斜纹夜蛾幼虫死亡率达到75.56％,与Bt毒蛋白表达量相一致;在盐胁迫下,转基因烟草的叶片生长状况均好于对照(非转基因)烟草的生长.证明BtCry1Ac基因和NTHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的抗虫性和耐盐能力.     

桑树MaDFR的克隆及功能分析

【目的】克隆桑树（Morus alba L.）二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase,DFR）基因,并通过烟草过表达研究其对烟草黄酮生物合成的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR的方法从桑树中克隆出MaDFR,采用农杆菌介导的遗传转化技术,将MaDFR导入模式植物烟草中,获得具有卡那抗性的转基因烟草植株,通过基因组PCR鉴定转基因阳性植株,采用反向PCR的方法分析T-DNA在烟草中的插入位点。通过定量PCR的方法分析MaDFR在烟草中的表达水平,AlCl₃分光光度法测定转基因烟草中总黄酮含量,通过DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）清除能力分析总黄酮酸水解前后的抗氧化活性,最后通过高效液相色谱（HPLC）分析烟草花冠中花青素的含量及种类。【结果】从中桑5801中克隆并获得了全长为1 026 bp的MaDFR,编码341个氨基酸残基,其蛋白质具有典型的NADPH结合位点。获得7株具有卡那抗性的烟草转基因株系。分子鉴定4株为转基因阳性株系。MaDFR在转基因烟草中能够表达,但不同转基因株系之间MaDFR表达水平存在较大差异。转基因烟草叶片中总黄酮含量明显增加,其中,DFR-4和DFR-7 2个株系分别增加了30.4%和27.6%,DFR-2和DFR-5分别增加了19.8%和14.2%。抗氧化活性分析发现转基因株系叶片中未酸解总黄酮抗氧化活性存在较大差异,DFR-2、DFR-4的抗氧化能力比对照组提高了近5倍,而DFR-5和DFR-7与对照组没有显著性的差异,转基因株系叶片中总黄酮的抗氧化活性与MaDFR的表达水平具有显著的正相关性。转基因株系叶片中酸解总黄酮抗氧化活性与总黄酮的含量具有显著的正相关性。MaDFR在烟草中的过表达能够增加花冠中花青素的含量,DFR-4株系中花青素含量增加了15%,DFR-5和DFR-7 2个株系中花青素的含量增加了一倍,但转基因烟草花冠中花青素种类没有发生改变。【结论】MaDFR在烟草中的过表达能够显著增加烟草的总黄酮含量及抗氧化作用,也可以显著增加烟草花冠中花青素的含量,但不能改变花青素的种类,说明该基因在矢车菊素类花青素的生物合成代谢路径中具有重要作用。     

CYP6CM1基因RNA干扰载体的构建及转基因烟草对烟粉虱抗药性的影响

烟粉虱的抗药性与体内细胞色素P450单加氧酶基因的过量表达有关。根据Q型烟粉虱一个P450基因(CYP6CM1基因)的特异区域构建RNAi载体,通过农杆菌介导法转化烟草,PCR检测获得6个独立转基因株系;以非转基因烟草和T1代转基因烟草饲喂烟粉虱5 d后,荧光定量PCR结果显示取食转基因烟草的烟粉虱体内CYP6CM1基因相对表达量仅为取食非转基因烟草烟粉虱的13%～27%,表明CYP6CM1基因RNAi表达框架可以干扰烟粉虱CYP6CM1基因的表达。     

EuCAD 基因小片段 RNAi对烟草木质素合成的影响

【目的】深入研究尾叶桉(Eucalyptus urophylla)肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD)基因序列中的关键片段并利用其进行木质素合成调控。【方法】采用生物信息学工具对EuCAD基因进行序列分析,根据编码蛋白保守结构域的分布情况进行筛选,获得一段44 bp关键序列用于构建RNA干扰载体并转化烟草,获得转基因植株并对基因表达水平、木质素含量等表型进行检测。【结果】获得28个转基因株系,转基因植株正常生长发育,与野生型无异,随机挑选3个株系进行检测,发现CAD基因表达水平均较野生型显著降低,以R1株系降幅最大,降至野生型的12.51%。对R1株系进一步检测发现,其茎部直径与野生型无异,但木质部厚度较野生型显著降低,其中第4节处降低11.75%,第6节处降低10.06%,茎部整体木质素含量较野生型降低15.26%。表明该RNAi片段显著抑制烟草中CAD基因表达并影响烟草木质素合成。【结论】通过序列分析筛选出的EuCAD基因小片段,可通过RNA干扰显著影响烟草木质素合成,为尾叶桉木质素合成调控研究提供了技术参考。     

毛白杨PtPCP—like基因的克隆及其遗传转化初报

利用滤纸吸附噬菌体 PCR法,从毛白杨花芽cDNA文库中分离克隆了PtPCP-like基因cDNA全长序列,测序表明克隆得到的该序列全长595 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码91个氨基酸;经BLAST分析发现,该基因包含与拟南芥花粉外被蛋白基因相似的序列,命名为PtPCP-like。采用RT PCR技术检测PtPCP-like基因在各个组织部位的表达模式,结果显示在毛白杨的根和雄花芽中表达丰度最高,而在雌花芽部位表达丰度最低。并且构建35S∶∶PtPCP-like植物表达载体,采用农杆菌介导法将PtPCP-like基因导入烟草中,获得了一批阳性转化植株。采用qRT-PCR技术检测PtPCP-like基因在各个转基因烟草中的表达模式,结果显示在转基因烟草中各个株系均比野生型表达量高,且不同株系间相对表达量差异显著。      

正义、反义、干涉调控肉桂酰辅酶A脱氢酶基因对烟草的影响

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是在木质素合成途径中起到关键作用的酶,负责催化肉桂酰辅酶A类物质的还原反应生成相应的醛类化合物.分离得到毛白杨CCR基因的cDNA.将CCR基因以正义、反义和干涉的形式,通过农杆菌介导的方法转入烟草中,Southem杂交以确定转基因成功.在获得的转基因植株中,所有下调基因的植株都表现出可溶性酚酸含量下降,木质素含量也有明显的下降趋势,纤维素含量则有上升,可能是对木质素含量下降的一种代偿性增长.植物细胞壁组分的含量变化表明CCR基因可能是一个控制木质素代谢途径的一个很好的调控点.     

GRP1.8融合反义4CL1基因调控烟草木质素生物合成

该研究成功地将从刺槐 (Robiniapseudoacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的GRP1 8启动子 ,分别与GUS报告基因及从毛白杨 (Populustomentosa)中克隆的香豆酸连接酶 (4CL1)基因连接构建成GRP1 8 GUS和GRP1 8 anti 4CL1融合基因 ,转基因于烟草植物 .经组织化学检测分析 ,GUS基因成功地由GRP1 8启动子驱动定位于形成层表达 ;融合基因GRP1 8 anti 4CL1的表达明显地改变了转基因烟草植株的木质素和纤维素的含量和比例 .转基因烟草的木质素含量较对照平均降低了 13 7% ,而转基因植株的纤维素含量较对照升高了 15 6 % .     

茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

光诱导和组成型启动子控制柠檬酸合酶基因过量表达对转基因烟草耐铝性影响的比较

分别用光诱导型启动子(PrbcS)和组成型启动子(CaMV 35S)驱动柠檬酸合酶基因(cs)在转基因烟草中过量表达,比较转基因烟草中柠檬酸的含量和分泌量及其铝耐受性的变化.结果表明:诱导型转基因株系的CS酶活性是野生型的2.3～2.4倍,组成型转基因株系的酶活性是野生型的1.6～2倍;在30 μmol·L-1铝胁迫下,诱导型转基因植株的根相对伸长量是野生型的2.8～2.9倍,组成型的根相对伸长量是野生型的2～2.3倍;在无铝或300 μmo1·L-1铝胁迫下,转基因烟草叶片和根中柠檬酸含量均高于野生型,其中诱导型转基因植株叶片中柠檬酸含量高于组成型转基因植株,转基因烟草柠檬酸的分泌量分别是野生型的1.8～2.0倍和3.0～3.3倍;在有铝胁迫的珍珠岩基质上培养时,转基因烟草的生长情况好于野生型.这些结果证明,与CaMV 35S相比,采用PrbcS启动子控制cs基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量,同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量,从而增强其对铝毒害的抵御能力.     

梨咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因PbCCoAOMT1的功能验证

石细胞团的含量及大小是决定梨果实品质的关键因素之一。目前已知木质素是石细胞主要组成成分,而梨中木质素合成关键酶CCoAOMT的功能目前尚不明晰。为此,克隆PbCCoAOMT1编码区全长（MF346688.1）并构建真核表达载体pCAMBIA1301a-PbCCoAOMT1。通过农杆菌介导的浸花法将PbCCoAOMT1转化野生型拟南芥,利用分子检测确定获得阳性过表达PbCCoAOMT1拟南芥株系后,对其纯合T₃代株系花序茎进行木质素及次生细胞壁特异性染色。结果表明,在拟南芥中过表达PbCCoAOMT1可以一定程度上促进次生壁的发育及木质化。运用溴乙酰法测定拟南芥花序茎中木质素含量发现,转基因植株中木质素含量较野生型显著上升,为野生型的1.24倍。进一步说明PbCCoAOMT1在木质素生物合成中具有重要作用。     

Isolation and Characterization of a Cinnamoyl CoA Reductase Gene（CCR） in Pear（Pyrus pyrifolia）

Pear is a popular and commercially important fresh fruit, and its texture is related to the presence of sclereid formatted by parenchyma cell with lignification in vascular plants. Previous studies have demonstrated that content of lignin may be regulated by cinnamoyl CoA reductase（CCR） in various plants. However, the function of CCR in pears remains very limited. In the present study, we isolated a cDNA encoding CCR（PpCCR, GenBank accession No. KF999958） and its promoter（proPpCCR） from Whangkeumbae pear to investigate the function of CCR in lignin biosynthesis. PpCCR-GFP expressed in rice mesophyll protoplast demonstrated that PpCCR-GFP was localized in the cytoplasm, indicating that CCR may function in cytoplasm without localization signals. In transgenic plants carrying PpCCR, we observed higher lignin content compared with that in wild type plants, further suggesting that PpCCR can affect the lignin contents through regulating lignin biosynthesis in Arabidopsis thaliana. More studies in other plants are needed to confirm our conclusion.     

棉花亲环素基因GhCYP1的功能分析

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。