PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中使用UNG防遗留污染

设计了一对引物用于PCR检测对虾白斑综合征病毒，PCR扩增过程中用尿嘧啶-DNA糖基酶(UNG)防遗留污染。使用UNG时，该对引物的适宜dUTP和Mg^2 浓度分别为0．4mmol／L和2．0mmol／L；UNG存在时，PCR检测WSSV DNA的最低量为1pg，UNG的使用使PCR的检测灵敏度降低了1个数量级；进行正常PCR扩增前，0．5U UNG可消除至少10ng含dU的WSSV DNA的PCR扩增产物。     

白斑综合征病毒(WSSV)3种PCR检测方法的灵敏度比较

为了探讨不同PCR检测方法的灵敏度,分别利用TaqMan实时定量PCR、世界动物卫生组织(OIE)公布的巢式PCR引物(简称OIE)、黄海水产研究所种质资源与工程育种研究室(GB)设计的引物(简称GB)及2种巢式PCR对应的一步法PCR,对具有不同白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)含量的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)样品进行检测.结果显示,当使用已知病毒含量的标准品进行检测时,TaqMan实时定量PCR方法可以检测到l0个WSSV拷贝;OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法分别可检测到104和103个WSSV拷贝;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增时,分别可检测到5×104和2.5×104个WSSV拷贝;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物进行一步法PCR扩增时,分别可检测到104和5×103个WSSV拷贝.使用上述PCR方法分别对44份未知WSSV含量的样品进行验证,定量PCR方法检测阳性率为84.09%,OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法检测的阳性率分别为18.18%和27.27%;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率均为15.91%;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率分别为18.18%和20.45%.根据以上结果,PCR方法检测WSSV的灵敏度由高到低依次为:定量PCR、巢式PCR、一步法PCR.     

常规PCR与巢式PCR法快速检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)

对传统对虾白斑综合征病毒(WSSV)的PCR检测方法中的病毒模板DNA的提取方法加以改进,建立了一种快速检测克氏原螯虾(Procambarus clarkii)WSSV的PCR方法。本方法将克氏原螯虾肝胰腺组织匀浆液冻融3次进行差速离心后,在病毒沉淀中加入50μL蛋白酶K溶液,室温消化5 min,沸水中煮10 min后,10000 r/min高速离心5 min即可取上清液用于PCR扩增,结果显示:与传统的病毒模板DNA提取方法相比,本方法的PCR结果特异性强,扩增效率高,准确率高,可应用于快速大规模检测克氏原鳌虾中的WSSV。     

双重PCR同时检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)

根据Genbank中对虾白斑病由白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列,设计了两对能分别检测WSSV和IHHNV保守片段基因的特异性引物,而且这两对引物在同一反应体系中可以同时对WSSV和IHHNV的DNA模板进行多重PCR扩增,得到大小分别为110bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的扩增条带。对影响PCR反应的主要因素Mg“浓度和退火温度进行了优化,证明当Mg^2＋浓度为2．0～4．0mmd,退火温度为57～59℃时可获得最佳的扩增和检测效果。特异性试验结果表明,这两对引物检测WSSV和IHHNV具有很好的特异性,对其它对虾常见病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该反应体系最低能检测100pg的WSSV和IHHNV的DNA模板。临床检测表明,所建立的双重PCR方法可以适用于WSSV和IHHNV的同时检测和鉴别。     

2013年中国典型对虾养殖区白斑综合征病毒流行株高变异区序列的分析比较

为了解中国不同地区白斑综合征病毒的流行变异情况,本研究取用2013年3—12月从7个省市发病地区采集到的64份WSSV阳性样本,以特异的引物扩增目的片段,通过测序分析不同样本的缺失及变异差异。结果显示,在开放阅读框ORF14/15的扩增中,分别有6530 bp、6533 bp和5138 bp的片段缺失,而在ORF23/24扩增中有12070bp大片段的缺失,不同地区样本中未能成功扩增ORF75,而ORF94的重复单元数目分别为0、3、4、12不等,ORF125的重复单元数目为0、7。SNP分析表明,含有3个重复单元的ORF94在48位的碱基为T、T、T,重复单元数为4的在48位的碱基为T、T、T、T,重复单元数为12的在48位的碱基分别为T及11个A。而ORF125所有重复单元数为7的情况在8、18、25、66、69位置的碱基均为G、G、G、G、A,在9、50、53、61位的碱基也普遍出现了变异。结果表明,WSSV在中国不同地区存在一定程度的变异,其在序列中的缺失、重复单元数目以及SNP的差异较为明显。     

对虾白斑综合征病毒免疫防治研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是一种引起养殖对虾爆发性死亡的病毒,由于它宿主范围广、蔓延速度快以及致死率高,已经成为对虾养殖中的第一杀手,因此有效防治WSSV爆发在水产养殖中具有重要意义并极具挑战性。本文主要介绍WSSV基因组以及结构蛋白、对虾WSSV免疫机制、对虾WSSV疫苗研究进展,以及我国对虾养殖中WSSV防治措施,认为对虾WSSV疫苗将是今后对虾大规模养殖中病害防治的一种重要手段。     

对虾白斑综合征病毒蛋白质组的研究进展

白斑综合征病毒WSSV(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是引起对虾大规模死亡的主要病毒性病原,且该病毒感染的宿主广泛。自WSSV基因组全序列公布以来,国内外的学者对WSSV的研究热点转移到该病毒基因产物功能的相关研究上面来。弄清WSSV感染机理是有效防治病毒的基础,而对其感染机理的阐释则主要是搞清病毒各蛋白在感染中的作用,这些是WSSV蛋白质组学的研究内容之一。分析WSSV蛋白同时可以在分子水平上为研究海洋和陆地生物病毒的进化趋势提供有力的基础。     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

应用PCR检测太湖青虾白斑病毒和桃拉病毒

白斑综合征和桃拉综合征是严重危害虾类养殖业的两种传染性疾病,病原的快速检测是控制疾 病暴发,减少病害损失的有效方法之一。青虾是太湖地区的主要养殖虾类,本实验应用白斑病毒和桃拉病毒 复合式试剂盒,对太湖附近的青虾进行检测,结果未发现太湖青虾感染或携带这两种病毒。     

多重PCR检测对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒

采用对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒的特异引物,在一个PCR反应中同时扩增到大小分别为271 bp和356 bp的病毒特异片段,多重PCR条件优化后可从最少100 fg级病毒DNA模板中定性检测出此两种病毒。     

聚合酶链反应（PCR）检测养殖对虾的白斑症病毒（WSSV）感染

对虾WSSV病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Kimura引物 ,用PCR技术对不同生长期的中国对虾 (Penaeuschinensis)进行了WSSV的检测 ,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹 (Helicesp .)和矛尾刺虎鱼 (Acanthogobiushasta)。检测结果表明 :分别在检测的 5尾亲虾中的 1尾 ,6尾仔虾中的 1尾 ,5尾稚虾中的 3尾及所检测的 5尾病虾和 2只厚蟹中获得到 982bp的PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阳性。在检测的 2尾矛尾刺虎鱼中均未获得PCR扩增产物 ,说明为WSSV感染阴性。在亲虾、虾苗以及虾池内的野生厚蟹中检测到WSSV感染的阳性结果表明 :WSSV感染的亲虾有可能是病毒的储主 ,WSSV感染的野生厚蟹有可能是病毒中间宿主或病毒的携带者 ,它们在对虾WSSV病的感染、传播中起了重要的作用     

聚合酶链反应（PCR）检测养殖对虾的白斑病病毒（WSSV）感染

对虾ＷＳＳＶ病是亚洲对虾养殖业中的一个棘手问题。本研究采用Ｋｉｍｕｒａ引物,用ＰＣＲ技术对不同生长期的中国对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）进行了ＷＳＳＶ的检测,同时也检测了对虾发病时养殖池中多见的野生厚蟹（Ｈｅｌｉｃｐ ｓｐ．）和柔尾棘虾虎鱼（Ａｃａｎｔｈｏｇｏｂｉｕｓ ｈａｓｔａ）。检测结果表明：分别在检测的５尾亲虾中的１尾,６尾仔虾中的１尾,５尾稚虾中的３尾及所检测的５尾病虾和２只厚     

WSSV蛋白酶性质的研究

从感染白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)的对虾中提取和纯化WSSV,对其蛋白酶活力进行分析。结果表明,WSSV蛋白酶具广泛的pH稳定性,当pH达7.5时,蛋白酶活性最大;pH高于10 0时,酶活力很低,其蛋白酶偏碱性。丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活性有抑制作用。Ca2 、Mn2 、Fe2 和Cu2 可降低WSSV蛋白酶活性,但Mg2 有轻微的激活作用。胰蛋白酶抑制剂在浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性无影响。Leupeptin使蛋白酶活性降低12.29%。Chymostatin在质量浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性有强烈的抑制作用,表明WSSV蛋白酶类属胰凝乳蛋白酶。蛋白质修饰剂对WSSV蛋白酶活性影响的研究结果表明,组氨酸残基为WSSV蛋白酶活性基团,而巯基为非必需基团,说明WSSV蛋白酶为非巯基依赖型的蛋白酶。     

乳山对虾养殖场白斑综合征病毒(WSSV)调查研究

2002年采用PCR-核酸探针斑点杂交法检测了乳山对虾养殖场1000余份样品携带白斑综合征病毒(WSSV)的情况。结果显示,639例对虾样品中阳性检出率为26·6%;77例蟹类样品中阳性检出率为18·2%;266例浮游动物样品中阳性检出率为38·3%,3~9月份浮游动物阳性率呈下降趋势,消毒后水体中浮游动物的阳性率仍很高;30例贝类样品检测均为阴性;204例底泥样品中,阳性检出率为17·6%,22例抽滤海水样品检测均为阴性。结果表明,虾、蟹类在传播WSSV中起着重要作用,贝类、海水传播WSSV的可能性很小,浮游动物、底泥在传播WSSV中的作用和机制应引起高度重视。     

Rotifer cellular membranes bind to white spot syndrome virus (WSSV)

Cell membranes from the rotifer, Brachionus urceus, were obtained by centrifugation and found to specifically bind white spot syndrome virus (WSSV) in vitro. This finding suggests that there is likely a WSSV receptor on the rotifer cell membrane and provides evidence that rotifers may be a host for WSSV.     

Experimental infection of European crustaceans with white spot syndrome virus (WSSV)

Eight European marine and freshwater crustaceans were experimentally infected with diluted shrimp haemolymph infected with white spot syndrome virus (WSSV). Clinical signs of infection and mortalities of the animals were routinely recorded. Diagnosis was by direct transmission electron microscopy (TEM), DNA hybridization (dot-blot and in situ hybridization) using WSSV probes and by PCR using WSSV specific primers. High mortality rates were noted between 7 to 21 days post-infection for Liocarcinus depurator , Liocarcinus puber , Cancer pagurus , Astacus leptodactylus , Orconectes limosus , Palaemon adspersus and Scyllarus arctus . Mortality reached 100%, 1 week post-infection in P. adspersus . When infection was successful, direct TEM observation of haemolymph revealed characteristic viral particles of WSSV, some observed as complete virions (enveloped), others as nucleocapsids associated with envelope debris. WSSV probes showed strong positive reactions in dot-blots and by in situ hybridization in sections and specific virus DNA fragments were amplified successfully with WSSV primers. White spot syndrome virus was pathogenic for the majority of the crustaceans tested. This underlines the epizootic potential of this virus in European crustaceans.     

对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的感染特性

应用克氏原螯虾作为动物模型研究对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）的感染增殖特性，涉及感染温度，感染途径，继发感染，半数致死量（ＬＤ５０），免疫保护及保存期等，结果显示，２２－２５℃时，接种ＷＳＳＶ的螯虾一般于２－７d内死亡，温度升高对病毒增殖影响不显著，３０－３２℃时，平均死亡时间２－６d，温度降低对病毒增殖影响较显著，１５－１９℃时，接种螯虾平均２－１０d内死亡，８－１０℃时，平均死亡时间３－６d，感染途径分别用腹节肌肉，腹节皮下洲射及口服，均能使螯虾感染发病，而浸泡方式不能使螯虾发病，细菌分离和细菌定量结果表明，寄考于螯虾心脏，肝胰腺内的阴沟肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是正常螯虾的２５和３０倍，形成继发感染，用螯虾心脏，肝胰腺内的阴肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是政党螯虾的２５和３０倍，形成继发梁。用螯虾测定ＷＳＳＶ的ＬＤ５０为１０^-6.5.mL^-1种毒液，将病毒５６℃，３０min灭活后免疫螯虾，不能使螯虾形成免疫保护，ＷＳＳＶ匀浆液－３０℃冻存１年后失活，而－３０℃冻存于螯虾体内ＷＳＳＶ保存１年后仍有活力。     

抗白斑综合征病毒(WSSV)感染途径研究进展

白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV),是引起养殖对虾大规模死亡的病原。在过去的10年中,各国学者不断地寻找预防和控制WSSV感染的方法及途径。本文主要介绍了中和抗体与噬菌体展示单链抗体、免疫增强剂、重组蛋白疫苗和灭活疫苗、遗传育种、RNAi等几种方法的研究现状,为进一步开发抗WSSV药物和饵料,更有效地防治WSSV及相关科研提供参考。     

WSSV具蛋白酶活性肽段的检测

在已有对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白酶活性研究的基础上,从分子水平上确定WSSV呈蛋白酶活性的肽段。采用凝胶电泳技术的蛋白酶酶谱分析法确定WSSV蛋白酶活性,研究非变性条件下WSSV多肽裂解的条件,确定低温(20℃)裂解WSSV多肽可满足实验的要求。同时使用SDS-PAGE分离胶切割法结合蛋白洗脱分离出Vp19、Vp22、Vp24、Vp26和Vp28共计5个肽段,并对分离的5个组分进行蛋白酶活性的检测,初步结果表明,Vp19具有蛋白酶催化活性。