新城疫F蛋白基因工程疫苗的研究现状

新城疫（Newcastledisease,NDV）是当今世界上最严重的禽类传染病之一,被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的传染病。同预防其他传染病一样,新城疫的主要防控手段仍是免疫接种。F蛋白是构成新城疫病毒（NDV）致病性的分子基础之一。综述了国内外新城疫F蛋白基因工程疫苗的研究进展。     

新城疫病毒分离株P基因的分子特性和遗传进化

【目的】探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)磷蛋白基因(P基因)的分子进化特点,为科学防控新城疫(Newcastle disease,ND)提供依据。【方法】对1997~2007年国内分离的13个NDV毒株的P基因进行扩增测序,与15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株P基因进行核苷酸和推导的氨基酸遗传变异分析及分子特性研究。【结果】国内NDV分离株P基因核苷酸和P蛋白氨基酸高度同源,同源性分别为93.9%~99.8%和93.4%~99.2%。国内NDV毒株与LaSota、Clone30和F48E9等P基因核苷酸和P蛋白氨基酸同源性分别为82.2%~87.7%,81.3%~83.8%;与国外毒株则分别为82.1%~90.2%,81.1%~90.7%。氨基酸序列分析表明,我国毒株具有独特的氨基酸位点。分子进化分析表明,NDVP基因中核苷酸同义替代率高于非同义替代率。【结论】国内分离NDV毒株P蛋白遗传距离较近,而与LaSota、Clone30、F48E9以及国外毒株遗传距离较远,有一定的地域性。NDVP基因以净化选择的方式进化。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

兰州地区NDV的分离鉴定及M蛋白的原核表达

为了分离出兰州地区鸡群新城疫病毒(NDV,Newcastle disease virus)并将M蛋白进行原核表达。通过鸡胚尿囊腔接种培养分离得到的兰州地区NDV,采用血凝及血凝抑制实验和Western bolt对病毒进行鉴定。利用分子克隆方法将NDV M蛋白进行原核表达,用Western blot技术分析其反应原性。根据NCBI发表的NDV M基因构建进化树。结果表明,成功分离的NDV悬液经RT-PCR技术扩增出M基因片段,重组菌p ET-M经SDS-PAGE分析,在约42 k Da处有一明显的蛋白条带,Western blot技术证明其具有良好的反应原性。M基因进化树分析,分离毒株与La-Sota具有极高同源性。本研究成功分离出兰州地区NDV并将M蛋白进行原核表达,同时确定分离毒株与La-Sota毒株的同源性极高。为后续针对兰州地区新城疫流行病学调查和综合防控技术提供实验依据。     

新城疫不同宿主源分离株的生物学特性

选择6株(鹅DC01、鸡WJ10001、鸽DZ01、鸽DZ02、鸭NJ10、鸭SD09)分离自鸡、番鸭、鹅、鸽的新城疫病毒,接种于10日龄无特定病原体(SPF)鸡胚中,通过测定鸡胚平均死亡时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)及融合蛋白(F)裂解位点氨基酸序列,研究其生物学特性和分子流行病学特征.结果显示,6个分离毒株均为新城疫病毒(NDV)强毒株.对F基因的序列测定和遗传关系分析表明,2株鸭源NDV强毒株(鸭NJ10、鸭SD09)与1株鸭源NDV山东流行毒株(鸭SDWF2005)高度同源;2株鸽源NDV强毒株(鸽DZ01、鸽DZ02)与1株鸽源DNA强毒株(鸽JS2000)高度同源.6株不同宿主源毒株的基因型分别为Ⅵ型和Ⅶ型,是中国目前流行的NDV毒株型.     

4株新城疫病毒F蛋白和HN蛋白的计算机模建与表面抗原分析

选取新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)广东分离毒GM株(强毒株)和JM株(弱毒株)以及疫苗毒La-Sota株和标准强毒F48E9株,对其融合蛋白(F)和神经氨酸酶(HN)的编码基因序列进行分析,并利用Insight II软件包(Version 2000)进行F蛋白和HN蛋白C端蛋白单体的空间结构模建.结果显示,4个NDV毒株F蛋白单体分子的空间结构极为相似,大致分为3部分,即头部、茎部和柄部.其中头部结构主要由一些折叠股组成,茎部和柄部主要由螺旋结构组成.比较各毒株F蛋白表面蛋白溶剂可及表面积(ASA)后发现,该蛋白有5个线性B细胞表位和8个比较保守的抗原决定簇位点,蛋白头部残基的空间位置随毒株的不同而变异较大.GM株与F48E9株存在36个氨基酸残基的差异,JM株和LaSota株存在20个氨基酸残基的差异.研究结果还表明,4个NDV毒株的HN蛋白C端空间结构较保守,由多个折叠股和4段螺旋结构组成,其抗原决定簇位点也高度保守,只有4个氨基酸残基存在差异.     

40株新城疫病毒全基因组的比较研究

利用作者单位测得的和从GenBank检索得到的40株新城疫病毒(NDV)全基因组序列,采用SMS、DNAStar等生物信息分析软件,比较分析NDV全基因组的基本特征和分子进化规律.结果表明: 40株NDV全基因组核酸序列长度有3种:15186、15192、15198 nt,均符合6倍数规律;基因组A T含量占53%～54%,C G含量占46%左右;NDV基因组前三分之一(4500 nt前)序列存在高GC含量区,特别是在大约1200～2400 nt区域,GC含量最高达到69%;F基因片段构建的分子进化树显示,40株NDV划分为两大类(ClassⅠ,ClassⅡ),基因组长度为15198 nt的毒株属于ClassⅠ,其余的属于ClassⅡ;ClassⅡ毒株又分为基因Ⅰ～Ⅶ型,这些已测序的毒株中没有基因Ⅷ和Ⅸ型;病毒6个基因CDS序列构建的进化树显示,各基因进化基本保持一致,仅少数毒株存在差异,可能与病毒分子的基因重组有关.     

新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒(NDV)融合蛋白和禽流感病毒(AIV)核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156 bp和219 bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT-PCR.试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性.经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H5亚型AIV的最低病毒量分别为103.7EID50和103.9EID50.试验结果表明,此次建立的一步法复合RT-PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV感染的快速鉴别.     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。     

含佐剂蛋白的鸡新城疫冻干疫苗对雏鸡免疫效力的研究

研究了佐剂蛋白大肠杆菌热敏性肠毒素LTRG与鸡新城疫疫苗(NDV)联合冻干制品的免疫效果。选择不同剂量的佐剂蛋白与鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota抗原配比,按生产程序制备冻干疫苗。经滴鼻途径免疫雏鸡,检测血清抗体、粘膜抗体水平,分析不同配伍疫苗的免疫效果。结果表明:含4μg LTRG佐剂蛋白的NDV冻干疫苗,免疫雏鸡血清IgG抗体水平明显高于其他添加组及NDV疫苗组,差异显著;粘膜IgA抗体与NDV疫苗组比较,差异极显著。LTRG佐剂蛋白与鸡新城疫疫苗配伍制备冻干疫苗,能增强免疫雏鸡的免疫应答能力,尤其是可产生较好的粘膜抗体水平。     

鸡胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

选取对新城疫病毒(NDV)易感的鸡胚成纤维细胞(CEF),Trizol提取细胞总RNA,用SMART技术合成双链cDNA,然后利用同源重组的方法在酵母细胞内构建CEF的cDNA文库,以寻找与NDV基质(M)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,探讨其相互作用对NDV装配和出芽的影响.结果表明:提取的细胞总RNA的D260nm/D...     

十三种中药水煎液体外抗鸡新城疫病毒的研究

鸡新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是危害家禽生产的重要病毒之一.试验选取黄芪、紫胡、金银花、野菊花、黄芩、藿香、芦根、细辛、栀子、甘草、马鞭草、鱼腥草、大青叶13种中药的提取液在传代细胞系鸡胚成纤维细胞(DF-1)上进行抗NDV试验,通过细胞病变效应(CPE)和噻唑蓝活细胞染色法(MTT),检测13种中药提取液分别对正常DF-1的细胞毒性以及NDV感染DF-1细胞的预防、治疗和直接灭活作用.结果表明:黄芪、野菊花、马鞭草和细辛提取液对NDV有显著地直接灭活作用;黄芪、金银花、野菊花和细辛提取液有显著的阻断NDV吸附作用;黄芪、金银花、野菊花和马鞭草提取液具有显著抑制NDV生物合成作用;综合以上结果说明黄芪、金银花、野菊花、马鞭草和细辛提取液的抗NDV作用较好.为抗NDV中药研究和临床用药提供了相关的试验数据.     

我国部分地区近年来新城疫病毒流行株分子生物学特征的研究

参考GenBank中的新城疫病毒（NDV）的基因序列,在F基因的3’端相对保守区设计1对引物,利用RT-PCR方法对华南农业大学兽医学院禽病学教研室近几年来分离并保存的24株新城疫病毒毒株的F基因进行了扩增,其扩增长度为450bp．测序结果表明：近十几年来,我国流行的新城疫毒株主要为基因Ⅶ型,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112～117）强毒株的氨基酸序列特征,并从分子水平上进一步证明我国最近流行的NDV主要为基因Ⅶ型NDV强毒株．     

一株新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以PCR扩增新域疫病毒JZ05株的F基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株,基因与另外18个NDV毒株F基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明.NDV JZ05株F基因产物F0蛋白酶裂解位点(111~117位)的氨基酸序列为GRRQKRF.与18个NDV毒株F蛋白的氨基酸序7,1对比,半胱氨酸残基数目和位置完全一致;仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有5处;而其F蛋白细胞融合活性位点中的一些保守氨基酸残基都没有发生变更.10个毒株(Ch98、Ch2000、YN、JZ05、JS01、GD05、SCL03、SSX03、Lye01、TW)之间全长氨基酸序列的同源性均在96%以上,这10个毒株与3个疫苗毒株(LaSota、B1、Clone30)的同源性在88.07%～89.51%.     

鸡新城疫病毒分子生物学特性及检测方法研究进展

鸡新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起的一种急性败血性传染病,是危害养鸡业发展最严重的疫病之一.NDV属于副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎病毒属,是一种有囊膜的负链RNA病毒[1].     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

新城疫病毒HN09-69株P基因的克隆、序列分析及表达

【目的】对新城疫病毒(NDV)HN09-69株P基因进行克隆、序列分析和表达鉴定,为研究P和V蛋白的功能,及NDV新流行毒株的免疫预防提供理论依据。【方法】以HN09-69株NDV为研究对象,根据GenBank上发布的相关P基因参考序列设计引物,进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析,将P基因的核苷酸序列与相关参考株的P基因序列进行比对分析并构建进化树。将P基因克隆到原核表达载体PET28a(+)中,得到重组质粒rPET28a(+)-P,将重组表达质粒转化到BL21（DE3）中诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测表达情况。【结果】扩增出了HN09-69株P基因的ORF,序列长度为1 188 bp。NDV HN09-69株核苷酸与弱毒株La Sota、clone-30同源性分别为82.5%和82.4%,与强毒株F48E8同源性为84.9%,与鸭源,鹅源NDV核苷酸同源性分别为97.9%～98.4%和96.0%～98.0%。SDS-PAGE电泳和Western blotting检测结果表明,重组P蛋白分子质量约为54 ku,符合预期结果,在大肠杆菌中主要以可溶性的形式表达。【结论】NDV HN09-69株与SDWF-02和SD-09鸭源强毒分离株同源性高,亲缘关系近。重组P蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

鸡新城疫病毒F_(48)E_8毒株多肽的特性测定

试验用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鸡新城疫病毒(NDV)F_(48)E_8毒株的多肽结构,发现该病毒用2-疏基乙醇降解后的74kHN蛋白是非降解状态下125kL'蛋白的降解产物,该结果经免疫电泳转移试验(WB试验)得到了证实。WB试验中,抗NDV单克隆抗体能与一条或数条NDV F_(48)E_8毒株多肽发生反应。     

新城疫病毒的一般生物学特性及其致病的分子基础

新城疫病毒(NDV)所致疫病鸡新城疫(ND)又称亚洲鸡瘟,是禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性急性败血性传染病,严重危害养禽业的发展。我国于1935年首次发现有ND的流行,但到1948年才得以最后证实。由于ND给世界养禽业造成的巨大损失,故对其病原NDV的研究一直是禽病研究的重点。现就新城疫病毒的一般生物学特性及其致病的分子学基础综述如下。