辽宁地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解近年来辽宁地区猪瘟流行毒株的遗传变异情况,本试验利用RT-PCR方法对2006年～2011年辽宁地区发病猪群中猪瘟病毒感染情况进行了检测并获得了20株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的扩增片段,测序后得到276 bp的E2基因编码序列;并在此基础上利用DNAStar和MegAlign等软件对所测定的20株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对.结果表明,20株猪瘟野毒株分别属于基因2.1、2.2亚型和1.1亚型,其中基因2.1亚型已经成为辽宁地区猪瘟病毒的优势流行毒株.属于基因2.1亚型的猪瘟野毒株与疫苗株之间的同源性在76.8％～80.5％之间,与经典强毒Shimen株的同源性在77.4％～81.1％之间.而病毒E2基因变异位点主要分布在所测序列的前30个氨基酸,与强毒Shimen株、疫苗株相比其变异率高达20％以上.说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性,并且多数毒株已向远离强毒Shimen株、疫苗株方向变异.     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

猪瘟病毒贵州株E2基因序列分析

为了解猪瘟病毒贵州株GZPD E2基因变异情况,为贵州猪瘟疫苗的选择提供参考依据,试验采用RT-PCR方法对GZPD E2基因进行扩增,并对目的基因进行克隆、测序和序列分析。结果:(1)RT-PCR扩增获得大小为1 343 bp的基因片段,与预期扩增大小相符。(2)目的基因克隆、测序分析显示,GZPD与国内毒株shimen株、C株等在 E2基因上存在较高的同源性,为94.9%～99.9%;与国外毒株GPE、Koslov等的核苷酸同源性为95.1%～95.3%。(3)进化分析显示,GZPD与HuBei、C-ZJ-2008、C-strain、HCLV处于同一进化分支,而与shimen、CSFV-GZ-2009、Koslov、GPE处于不同的进化分支。结果表明:猪瘟病毒贵州株GZPD在 E2基因上存在一定变异,提示贵州猪瘟病毒存在一定的进化。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）扩增并测定了6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C-株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明，6株流行野毒与C-株疫苗毒的核苷酸同源性为82%-84%，流行野毒之间的核苷酸同源性在89%-99%之间，并且明显可分为二个组群，病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C-株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C-株毒对流行野毒的中和滴度。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因克隆及生物信息学分析

利用Gen Bank登录的猪瘟病毒(CSFV)参考株(登录号:NC_009089.1)的E2基因序列设计特异性引物,PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CSFV疫苗株E2基因,将PCR扩增产物克隆入Pet-32a-BL21载体构建重组质粒门Pet-32a-E2,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的Pet-32a-E2质粒含有1个开放阅读框(ORF),全长1119 bp,共编码373个氨基酸,与Gen Bank登录的CSFV参考株NC_009089.1的E2蛋白的核苷酸同源性为98.8%,氨基酸同源性为98.9%;与石门株兔化弱毒E2蛋白株的核苷酸同源性为94.4%,氨基酸同源性为93.9%。对E2基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示,E2蛋白分子质量为41.6 ku,等电点PI为5.72,是弱酸性蛋白;E2蛋白不含信号肽序列,为可溶性蛋白,有跨膜区,主要定位于细胞质内。通过生物信息学分析预测,为后期CSFV E2蛋白表达,开展蛋白功能研究奠定了基础。     

猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。     

山西猪瘟野毒株E_2基因序列测定与遗传变异多样性分析

为了解山西地区猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法,2013年从山西部分地区分离出5株CSFV流行毒株,并进行了E2全基因扩增、克隆与序列测定,应用DNAStar分析软件对所测定的5株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析,绘制系统发育进化树。结果表明：5株CSFV流行毒株之间E2基因核苷酸序列与所推导氨基酸序列的同源性分别为81.4%~100%和87.9%~100%,与CSFV石门毒株（Shimen株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为82.9%~94.8%和89.0%~94.9%,与CSFV兔化弱毒株（HCLV株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.6%~99.6%和87.9%~99.5%,与17株来自各国不同地区的CSFV参考毒株的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.5%~99.6%和86.3%~99.7%。经系统发育关系分析,4株属于基因2群,且705、713、725、729、734和738位氨基酸发生置换,另外1株属于基因1群。本研究揭示了山西猪瘟流行毒株的遗传变异多样性现状。     

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV—1）UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响，构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3．1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3．1 E2-UL49。将pcDNA3．1-E2与pcDNA3．1-E2-UL49分别转染293T细胞，间接免疫荧光试验结果显示，单独表达E2蛋白的细胞，其荧光主要固缩于核周，而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光；Western-blot分析结果显示，VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达．但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些（P〈0．01），表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒石门株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计合成了9对引物，通过RT-PCR从感染猪瘟病毒的猪全血中扩增得到了覆盖猪瘟病毒石门株基因组全长的9个cDNA片段，将所得片段分别克隆至pOK12载体和pMD18-T载体，经测序和拼接后，获得了猪瘟病毒石门株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟病毒石门株基因组全长12297个碱基，含有一个大的开放阅读框架，编码1个由3898个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区（5＇UTR）和3’非编码区3’（UTR）分别由373和227个碱基组成，与已发表的2个猪瘟病毒石门株的全序列相比，核苷酸同源性分别为99．4％和99，6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．7％，在3’末端第12133位T碱基发生缺失。比较了27个猪瘟病毒全序列的3’UTR，结果提示12133位碱基T缺失区域可能是猪瘟病毒的高变异区。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究

为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。     

猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达

参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的基因组序列，设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1—6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX—KG中，经酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃，1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子量约为40ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western—blotting检测表明，表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

以纯化的猪瘟病毒（CSFV）重组E2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDEXX ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的E2-PPA-ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪瘟病毒石门株E2基因的RT-PCR克隆及鉴定

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从感染猪血中成功扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株Ｅ２基因,大小为１１８４ｂｐ,与预期大小一致。经巢式ＰＣＲ和酶切鉴定证实所扩增的片段为Ｅ２基因特异性片段。将扩增的Ｅ２基因克隆到Ｐ＾ＧＥＭ－Ｔ载体,采用限制性内切酶鉴定和ＰＣＲ技术了阳性重组子。