合浦珠母贝微卫星标记的家系筛选

对本实验室以前设计的170对合浦珠母贝微卫星引物进行家系筛选,共有35对引物可以有效扩增,其中30对引物在家系中具多态性。共检测到67个等位基因,片段长度范围为131～297 bp,平均有效等位基因(Ae)1.7988个,平均观测杂合度(Ho)为0.4801,平均期望杂合度(He)为0.4165,平均多态性信息含量(PIC)为0.3369。试验结果表明,本研究筛选的35个微卫星位点,可用于合浦珠母贝遗传多样性分析、遗传图谱构建以及分子标记辅助选育等研究。     

合浦珠母贝不同来源群体小片贝的育珠效果比较

用广东湛江的2龄合浦珠母贝作为插核母贝,选取1.5龄,30-35 g之间的三亚贝、印度贝和广东贝作为小片贝,研究不同小片贝对珍珠质量的影响.结果发现,从光泽来看,印度小片贝的优质珠比例(47.7%)显著高于三亚小片贝(40.0%)和广东小片贝(42.0%,P<0.05 ),但二亚小片贝的珍珠上层速度0.0538 (±0.0046 )mm/月显著高于广东小片贝珍珠的0.0521(±0.0045) mm/月.说明采用印度小片贝对提高优质珠的比例有一定的效果,采用三亚小片贝能提高珍珠质分泌的速度,小片贝和受体贝来源于相同群体时能增加商品珠比例.     

合浦珠母贝家系遗传多样性与性状相关性

采用8对微卫星引物对合浦珠母贝12个家系的遗传多样与性状的相关性进行分析,结果显示,平均等位基因数(Ao)、平均有效等位基因数(Ae)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和平均多态信息含量(PIC)等遗传参数与性状的表型参数总体上呈凸形曲线关系,表明中等遗传参数的家系性状表型普遍较好.但总体上,生长较快的家系,各遗传参数平均较大.     

合浦珠母贝不同地理种群的形态差异和判别分析

运用多变量形态度量学方法,采用9个形态特征对来自广西(GX)、雷州(Lz)、三亚(SY)和越南(YN)4个不同地理群体的合浦珠母贝的形态差异进行研究.主成分分析结果显示,第一主成分主要受7个性状的影响,贡献率为55.577％;第二主成分主要受1个性状的影响,贡献率为14.475％;第三主成分受1个性状的影响,贡献率为10.545％.主成分分析和聚类分析表明,LZ群体和YN群体形态相近,SY群体趋异程度最大.建立了GX、LZ、YN和SY4个种群的判别函数,判别准确率分别为50％、58％、60％和60％,总判别准确率为57.0％.合浦珠母贝4个种群的形态学差异是遗传和环境共同作用的结果,可为良种选育的亲本选择提供参考依据.     

海南新村港养殖合浦珠母贝主要多毛类寄生虫的流行病学调查

对海南新村港珍珠贝养殖基地的1～1.5龄和2龄以上的合浦珠母贝上的寄生多毛类的种类和数量做周年采样调查,并分析优势种的数量变化规律,结果表明,合浦珠母贝上的寄生多毛类主要有9种,其中缨鳃类、丝鳃类、才女虫类3种为优势种;贝龄越大,丝鳃类、才女虫类寄生虫总数量越多,而缨鳃类数量并无明显变化;2龄以上合浦珠母贝的3种主要多毛类寄生虫的总数量在10月份达到最高峰,而在1月份最低,其中缨鳃类数量的周年变化不显著,才女虫类的数量在4月份时达到峰值,而在10月份最低,丝鳃类的数量在10月份达到峰值,而在4月份最低。     

不同运输条件对合浦珠母贝稚贝存活比较

比较运输方式及环境温度对合浦珠母贝稚贝运输中的存活影响,从而为稚贝运输过程中的运输方式、环境温度及运输时间的把握提供借鉴和参考。以3月龄稚贝为实验材料,运用无水干露、加水淹没及包装充氧等3种方式,分别在环境温度为5、13、21和29℃下模拟运输。每隔3 h从每组运输条件下取出1组实验贝,转移到正常养殖环境下暂养恢复,经48 h后统计其存活率。对运输时间与存活率之间进行非线性参数曲线拟合,计算每组运输条件下的致死时间(T_0)、半致死时间(T_(0.5))及全致死时间(T_1);运用双因素方差分析,Duncan氏方法比较3种运输方式及4种环境温度间的均值。结果显示:包装充氧优于其他两种运输方式,而加水淹没又优于无水干露;温度为13℃和21℃时优于其他2个环境温度,环境温度为17.60～20.05℃是稚贝运输的最佳温度。     

合浦珠母贝抗菌肽粗提液制备方法的优化

研究了不同处理方法制备合浦珠母贝外套膜和鳃组织抗菌肽粗提液的抗菌活性,结果表明：以1.0×106cfu·mL^-1无乳链球菌刺激合浦珠母贝14 h以内对其粗提液抗菌活性无显著影响;合浦珠母贝外套膜或鳃组织抗菌肽粗提液制备时,IKAT-18匀浆机的匀浆效果要优于组织匀浆器和研钵。100℃水浴处理组织粗提液10 m in可显著提高其对溶藻弧菌的抗菌活性;反复冻融则会显著降低外套膜组织粗提液的抗菌效果。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

[目的]研究合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选。[方法]采用生物素标记的5个探针,用磁珠富集法构建合浦珠母贝基因组微卫星富集文库,并对文库进行筛选、测序与引物多态性筛选。[结果]对500个克隆进行PCR筛选,测序分析发现130个克隆含有微卫星重复单元。序列比对后最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆,其中包含179个微卫星DNA结构域。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在合浦珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物,其中8对在种群中（n=32）具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0．239～0．787;等位基因数在2～9个;观测杂合度介于0．22～0．56;期望杂合度的变化范围为0．25～0．83。[结论]这研究为进一步开展合浦珠母贝的遗传分析提供了基础资料。     

合浦珠母贝不同壳基质蛋白基因的表达水平比较

采用荧光定量PCR 技术分析了不同壳基质蛋白基因之间的表达水平差异,组织表达特征以及育珠对表达水平的影响。结果显示,msi31,aspein,msi7 基因只在外套膜组织中表达;nacrein 和n19 基因除在外套膜表达外,在珍珠囊中也有表达;而accbp 在外套膜、闭壳肌、性腺、消化腺、腮和珍珠囊中都有表达,在外套膜中表达量最高,其次为性腺。accbp、msi31、msi7和nacrein基因在育珠贝和非育珠贝外套膜中的表达水平有显著性差异,aspein与n19 无显著性差异;其中msi31 基因在育珠贝外套膜的表达量上调,accbp尧msi7与nacrein 下调。不论在育珠贝还是非育珠贝的外套膜组织中,msi31的表达水平最高,n19 最低;但在珍珠囊中n19的表达量最高,且远高于在外套膜中的表达水平。     

合浦珠母贝Pf-Cnot2基因的克隆与表达分布

采用RACE技术从合浦珠母贝外套膜组织中克隆得到了CCR4-NOT复合体第二亚基(Cnot2)基因,命名为PfCnot2。该基因全长2 616 bp,开放阅读框为1 725 bp,编码574个氨基酸,理论分子量为61 ku,理论等电点为6.25。蛋白序列分析表明它富含丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸,具有保守的NOT2_3_5结构域。系统进化分析显示Pf-Cnot2蛋白与脊椎动物的Cnot2蛋白进化关系较远。Pf-Cnot2在合浦珠母贝的外套膜边缘、外套膜缘膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃等组织中均有表达,在生殖腺中表达量最高。该基因从担轮幼虫期至幼贝期均有表达,担轮幼虫期表达量最少,D型期比担轮幼虫期有显著增高。上述研究结果为进一步了解Pf-Cnot2在合浦珠母贝中发挥的作用提供了基础数据。     

合浦珠母贝三亚养殖群体生长性状的相关与通径分析

随机测定200个2龄合浦珠母贝三亚养殖群体的壳长(X1)、壳高(X2)、壳宽(X3)、顶点-腹缘长(X4)、韧带槽长(X5)、韧带槽宽(X6)和体重(Y)7个性状指标,计算性状间的相关系数。采用通径分析方法计算以形态性状为自变量对体重作依变量的通径系数、决定系数及相关指数,进行各形态性状对体重影响大小的剖分。结果表明,合浦珠母贝除韧带槽宽外,其他性状之间的相关关系都达到极显著水平(P<0.01),体重与壳长的相关系数最大(0.9228)。壳长对体重的直接影响最大(0.5083),是影响体重的主要因素;壳宽与体重、壳高与体重的相关程度很大,但对体重的直接影响均较小,两者主要通过壳长间接影响体重,壳宽、壳高是影响体重的次要因素。决定系数分析结果与通径分析结果有一致的变化趋势。所选贝壳性状与体重的复相关指数为R2=0.8977;多元回归分析建立了壳长、壳高、壳宽估计体重的回归方程为:Y=0.6873X1+0.3182X2+0.9379X3-43.2267。本研究结果为合浦珠母贝育种过程中测量性状的选择提供了理论依据。     

合浦珠母贝家系的建立及生长性状的比较

以经过连续2代群体选育的合浦珠母贝为亲本,采用雌雄单个配对的方法,建立了10个合浦珠母贝家系,对家系的生长性状进行了比较研究。结果表明,壳长的大小顺序为F2>F7>F1>F10>F4=F5>F9>F6>F3>F8;壳宽的大小顺序为F5>F2>F1>F7>F4>F10>F9>F6=F8>F3;壳高的大小顺序为F2>F1>F5>F10>F4>F7>F6>F9>F8>F3;总重的大小顺序为F2>F1>F5>F7>F10>F4>F6>F8>F9>F3。在该批家系中,F2的壳长、壳高、总重均为最大,壳宽虽然小于F5,但无显著性差异,因此认为该家系具有较强的生长优势,可作为进一步选育的材料。通过分析发现,F1、F5家系的各个生长指标总体生长都较快,因此F1和F5家系也具有一定的生长优势,也可以选作为进一步选育的材料。     

合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片制备工艺优化及其质量分析

为丰富合浦珠母贝Pinctada martensii的食品种类,制备出酸甜可口、质量安全的合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片,以合浦珠母贝糖胺聚糖为主料,黏合剂、润滑剂、矫味剂和稀释剂为辅料,采用单因素试验和正交试验方法,确定最佳原辅料配比和最优工艺,原辅料经混合、制软材、干燥、整粒、压片等工序制备出泡腾片,并对制备的泡腾片进行质量指标检测和急性经口毒性试验。结果表明:合浦珠母贝糖胺聚糖泡腾片最优配方为(以质量百分比计)糖胺聚糖25%,崩解剂35%(碳酸氢钠与柠檬酸的配比为1∶2),矫味剂三氯蔗糖3%,黏合剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2%,润滑剂聚乙二醇(PEG) 4000 2%,余量为乳糖;按此最优工艺制备的泡腾片直径约为8 mm,重约为200 mg,硬度为5. 5～6. 5 kg,崩解时间<40 s;急性经口毒性试验表明,14 d观察期内SD大鼠均无异常行为及死亡。研究表明,用本研究优化工艺制得的糖胺聚糖片剂产品表面光滑整洁、口感良好,质量安全,稳定可靠,无毒副作用。     

合浦珠母贝家系间生长性状和感染多毛类寄生病的比较分析

对合浦珠母贝12个全同胞家系的生长性状和才女虫寄生病的感染情况进行比较分析,结果显示:筛选出的快速生长家系F10、F11、F3和F12与生长最慢的家系F7相比,壳高分别大16.01％、14.93％、10.51％和10.16％,体质量分别重35.72％、28.02％、25.98％和17.61％.筛选出的抗病家系F8、F9、F11和F10,其才女虫寄生病的总感染率与感染最高的家系F3相比,分别降低了48％、34％、27％和23％,表明这4个家系初步提高了合浦珠母贝抗才女虫寄生病的能力.筛选出的快速生长家系和抗病家系可作为选育的核心育种家系,为培育生长速度快和抗才女虫寄生病的合浦珠母贝新品系奠定良好的基础.     

2种贝龄合浦珠母贝数量性状的相关与通径分析

[目的]明确不同贝龄合浦珠母贝(Pinctada fucata)壳形态性状(壳高、壳长、壳宽和铰合线长)与产量性状(体质量、软体部质量和壳质量)间的相关性,筛选出对合浦珠母贝产量性状的影响因素及其决定程度,为产量性状的选育提供理论依据.[方法]随机选取形态较完整的1龄合浦珠母贝184只和2龄合浦珠母贝191只,分别测量其壳形态性状[壳高(SH)、壳长(SL)、壳宽(SW)和铰合线长(VL)]及产量性状[体质量(BM)、软体部质量(VM)和壳质量(SM)]后,使用SPSS 24.0进行相关分析和通径分析,并通过线性逐步回归分析建立多元线性回归方程.[结果]1龄合浦珠母贝壳形态性状变异系数在12.19%~15.15%,产量性状变异系数在30.90%~39.27%;2龄合浦珠母贝壳形态性状变异系数在8.90%~10.26%,产量性状变异系数在23.09%~29.23%.2种贝龄合浦珠母贝数量性状间的表型相关性均达极显著水平(P<0.01),各性状间的相关系数范围为0.564~0.955.1龄和2龄合浦珠母贝中进入最终多元回归方程的4个壳形态性状对其体质量的总决定系数(R2)分别为0.864和0.778;对合浦珠母贝体质量直接影响最大的壳形态性状在1龄贝中为壳宽、在2龄贝中为壳高,对应的通径系数分别为0.286和0.536;在壳形态性状对体质量的单独决定作用中,1龄贝以壳宽对其体质量的单独决定作用最大,2龄贝则是壳高对其体质量的决定作用最大,对应的决定系数分别为0.082和0.287.[结论]开展合浦珠母贝人工选育或留种时应根据不同贝龄进行相应性状的挑选,以体质量为选育目标时,在1龄个体中要首先考虑壳宽性状,在2龄个体中则应考虑壳高性状.     

合浦珠母贝幼体生长性状的遗传力及其相关性分析

以合浦珠母贝(Pinctada fucata)4种壳色选育群体为亲贝,采用人工授精技术对同一壳色亲本进行雌雄单个配对,获得了15个全同胞家系。测量5、15、25和40日龄时的壳长和壳高,利用方差分析比较不同壳色品系的生长差异;利用非求导约束最大似然法(DF-REML)对合浦珠母贝各日龄的壳长和壳高性状进行遗传参数的估计。结果表明,4种壳色系的壳长和壳高均存在显著差异(P<0.05);5～40日龄幼体壳长遗传力估计值为0.12～0.22,壳高遗传力估计值为0.17～0.23;合浦珠母贝幼体不同生长时期壳长和壳高的遗传相关和表型相关均为正相关,相关系数分别为0.825～0.989和0.832～0.965,表明以壳高或壳长为参数进行选育时,均可达到改良生长性状的效果。     

合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因特征与表达分析

研究了合浦珠母贝含硒谷胱甘肽过氧化物酶(命名为poSe-GPx)基因结构特征和在应激状态下的表达调控机制,其cDNA全长为1271 bp,5′-非编码区(UTR)长28 bp,3′-UTR长631 bp,包括4个RNA不稳定信号结构域(ATTTA)、1个保守的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和1个位于poly(A)尾巴上游22个核苷酸处的多聚腺苷信号(AATAAA).开放阅读框(ORF)为612 bp,编码由203个氨基酸组成的多肽,分子质量约23.1 ku,理论等电点为8.29.poSe-GPx第51个氨基酸为硒代半胱氨酸(Sec),由密码子TGA编码.poSe-GPx序列中存在1个保守的GPx签名序列75LGFPCNQF82、1个活性位点序列162WNFEKF167和1个糖基化位点87NCT89.利用MatGAT软件对poSe-GPx氨基酸序列和其他物种GPx序列进行同源性和相似性分析,结果表明:poSe-GPx与其他物种GPx序列具有较高的保守性,同源性为42%-55%,相似性为56%-71%.组织表达模式分析表明:poSe-GPx mRNA在消化腺、鳃、性腺、血细胞、闭壳肌、肠和外套膜中都有表达.免疫应激试验结果显示,在2和4 h时poSe-GPx基因在消化腺中的表达显著上调.     

合浦珠母贝选育组和对照组生长性状相关分析

收集合浦珠母贝(Pinctada martensii)F4选育组和对照组不同月龄生长数据,对壳长、壳高、壳宽和体质量进行相关和回归分析。结果显示,各月龄选育组和对照组生长性状间相关系数均达到极显著水平(P0.01),相关系数范围分别为0.47~0.88和0.44~0.92。除选育组6月龄壳宽与其他性状间相关系数大于对照组相应数值外,选育组生长性状间相关系数均小于对照组。各月龄选育组和对照组估算体质量的多元回归均达到显著水平(P0.05),方程判定系数(R2)范围分别为0.625~0.848和0.745~0.902,选育组方程判定系数均小于对照组。该研究结果为合浦珠母贝选择育种工作中确定重要目标性状提供了理论指导。     

合浦珠母贝C型凝集素2的序列特征和表达分析

构建了合浦珠母贝(Pinctada fucata)的cDNA文库,并通过EST序列筛选和重新测序获得了一个新的C型凝集素基因的cDNA序列,命名为PoLEC2,其长度为1 659 bp,5’端非编码区为39 bp,3’端非编码区为45 bp,开放阅读框为1 575 bp,可编码524个氨基酸;PoLEC2蛋白的分子量约58.0 kD,等电点为5.2;PoLEC2蛋白包含一个信号肽序列(M1-A16)、一个MAM-2结构域和一个C型凝集素的糖识别结构域。同源性分析结果表明,PoLEC2与其他物种C型凝集素的糖识别结构域序列的同源性在26.5%～33.6%,相似性在45.1%～55.6%。组织表达分析表明,PoLEC2基因在肝胰脏、鳃、外套膜、性腺及肠组织中均有表达,经溶藻弧菌刺激后8h在肠组织中的表达量显著上调。     

不同壳色合浦珠母贝生产性能评估及其雌雄群体间的差异

[目的]综合评价不同壳色合浦珠母贝(Pinctada fucata)雌雄群体的生产性能,为其良种选育及优质珍珠养殖提供理论指导.[方法]对4种壳色(金壳色、红壳色、黑壳色和白壳色)选育系及常规壳色合浦珠母贝雌雄群体间的数量性状(湿重、壳重、软体重、闭壳肌重、壳长、壳高、壳宽、铰合线长和闭壳肌拉力)和才女虫(Polydora ciliata)感染情况进行系统分析,综合评价其生产性能及雌雄群体间的差异.[结果]除闭壳肌拉力外,4种壳色选育系的数量性状均显著优于常规壳色合浦珠母贝(P<0.05),其中,红壳色选育系可作为以湿重、壳重、软体重、闭壳肌重、壳长、壳高和铰合线长为选育目标的最优选育群体,白壳色选育系可作为以闭壳肌拉力和壳宽为选育目标的最佳选育群体.4种壳色选育系的才女虫感染率均明显高于常规壳色合浦珠母贝,且以红壳色选育系的感染率最高、白壳色选育系的感染率最低.5种壳色合浦珠母贝间的性别分化存在极显著差异(P<0.01),其中,白壳色选育系和金壳色选育系为偏雄群体,红壳色选育系为偏雌群体.雌性合浦珠母贝通常比雄性合浦珠母贝大,但其闭壳肌拉力和抗才女虫感染能力与性别无关.[结论]白壳色选育系和金壳色选育系的综合育种价值较红壳色选育系、黑壳色选育系及常规壳色合浦珠母贝高,建议在今后的合浦珠母贝选育工作中,可根据需求加强对白壳色选育系和金壳色选育系的优化选育,并应用到优质珍珠生产中.