芜菁花叶病毒欧亚分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

 16个芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)欧亚分离物分别来自奥地利、丹麦、德国、匈牙利、尼泊尔和英国6国。利用免疫捕获反转录PCR(Immunocapture RT-PCR,IC-RT-PCR)对16个分离物的HC-Pro(Helper component pro-teinase)基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸。16个分离物的HC-Pro基因核苷酸序列同源性为79.5%~99.8%,所编码的氨基酸同源性为94.1%~99.8%。对16个分离物及GenBank上已报道的其它14个TuMV的HC-Pro基因核苷酸的系统进化树分析表明:在16个TuMV欧亚分离物中,除了来自亚洲的分离物N23属Asian-BR组,其余15个来自欧洲的分离物都属于world-B组,其中分离物H1归属world-wide亚组,另外14个分离物则归属New World亚组。     

芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及P3蛋白抗血清的制备

 用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒( Turnip mosaic virus,TuMV)的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%~99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%~99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。     

侵染番红花的芜菁花叶病毒

 从表现花叶症状的德国进口番红花上获得一线状病毒分离物SA,线状病毒粒子长度为700~800nm。其在人工接种的11科39种植物中能侵染6科14种植物,在克里芙兰烟上产生系统坏死,在小白菜、花椰菜等十字花科植物上产生系统花叶或为隐症,在昆诺藜等藜科植物上为局部侵染。在番红花病叶、球茎及克里芙兰烟病叶组织中观察到卷轴状和片层状聚集的风轮状内含体。免疫吸附和免疫修饰电镜观察结果显示,SA与芜菁花叶病毒((TuMV)具有紧密的血清学关系。根据这些特征将SA鉴定为TuMV的一个分离物。这是TuMV侵染番红花的首次报道。     

大白菜对芜菁花叶病毒(辽宁一号分离物)的抗性遗传规律研究

 经研究大白菜对芜菁花叶病毒辽宁1号株系(TuMVLn-1)的抗性是不完全隐性,至少受4对以上微效基因控制,亦较大地受环境敏感基因的影响,因而具有较显著的数量性状遗传的特点。在回交测验中,发现明显的核遗传。但同细胞质又有密切关系。通过配合力分析:一般配合力(G.C.A)和特殊配合力(S.C.A)的方差都达到极显著水准,其比值(G.C.A/S.C.A)为13.28,说明其加性效应起主导作用。因此,在进行抗病育种时,以轮回或自交选择较易获得高抗品种:在选配优良杂交组合时,应使双亲都具有高抗性,同时亦应注意父母本抗性的差异。     

芜菁花叶病毒对油菜致病力差异及壳蛋白基因序列分析

 2004年春季参试的湖北、安徽2省11个芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)分离物感染4个油菜品种,病情指数幅度为26.2~76.0;秋季参试5个TuMV分离物感染14个油菜品种,病情指数幅度为38.3~55.9,均值方差分析表明,致病力差异分别达到极显著和显著水平。壳蛋白(CP)基因序列分析表明,来源于2省油菜、白菜、红菜薹、芝麻和萝卜的17个TuMV分离物与浙江分离物ZJB3序列同源性在97%以上,同属于MB类群;而另一个萝卜分离物WRS1与ZJR1、CH1和CH2分离物序列同源性在95.4%~98.7%之间,属于MR类群。类群间分离物序列同源性仅为88.0%~92.2%。遗传进化树分析表明,萝卜分离物WRS2在MB类群中单独构成一个分支,可能是MR类群和MB类群发生重组的后代。     

侵染花椰菜的芜菁花叶病毒及RT-PCR扩增外壳蛋白基因研究

 从杭州市郊区及本校附近菜园地表现严重花叶症状的花椰菜上分离到一种线状病毒,接种6科31种鉴别寄主,能侵染5科22种植物。病组织超薄切片可见风轮状内含体和片层聚集状内含体。感病的芥菜叶片,用0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)匀浆后汁液加4% PEG-8000沉淀3h,5%~40%甘油梯度离心纯化病毒,可获得较高的产量。提纯的病毒均为一弯曲的线状颗粒,长度740nm左右。病毒提纯液于264nm处有一吸收峰,为典型的核蛋白紫外吸收。TuMV-H分离株抗血清包被的铜网能大量吸附病毒颗粒。用特异的PCR引物扩增其外壳蛋白基因,可得-0.9Kb的片段。     

甘蔗花叶病毒福建分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 A fujian isolate of Sugarcane mosaic virus named SCMV-FJ was isolated from infected sugarcane. Cloning and sequence analysis of the coat protein gene of this isolate was carried out. A pair of primers was designed and synthesized based on the nucleotide sequences of coat protein genes of sugarcane mosaic viruses reported. The coat protein gene of SCMV-FJ was amplified from the extracted total RNA of the infected sugarcane by using RT-PCR, and cloned into the pMD18-T vector. The sequencing result indicated that the cloned segment included a 1137 bp open reading frame(ORF) and a 228 bp 3' untranslated region, in which the ORF comprised the whole coat protein and part of the nuclear inclusion b. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene were compared with those of the other isolates or strains of SCMV subgroup reported in GenBank. The result showed that it shares 56.8%-97.1% and 55.3%-99.4% homology in nucleotide and the putative amino acid sequences, respectively, with the highest amino acid homology of 99.4% with SCMV-D. Thus it was identified as a SCMV-D. This experiment provided a rapid, sensitive and relatively inexpensive method for RT-PCR detection of SCMV. At the same time, the cloning of SCMV-FJ coat protein gene provided the foundation for plant gene engineering against SCMV.     

玉米矮花叶病毒北京分离物复制酶基因的克隆及序列分析

 以MDMV北京分离物RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增了含复制酶(NIb)基因的DNA片段,将其克隆到p UC18载体上并进行序列分析。结果表明:NIb基因由1563个碱基组成,编码521个氨基酸并含有高度保守基序GDD。NIa/NIb和NIb/CP交界处的蛋白酶切割位点分别为Q/C和Q/S-NIb基因(北京分离物)在碱基数目上与保加利亚分离物完全一致,二者的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为70.6%和76.6%,而与SCMV-SC的核苷酸及氨基酸序列同源性则高达81.3%和92.1%。     

小麦黄花叶病毒(WYMV)2个山东分离物的全基因组序列及进化分析

利用5'RACE结合一步法RT-PCR分别从山东泰安与临沂冬小麦上克隆了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的全基因组序列。这2个分离物(TADWK和LYJN)基因组间核苷酸一致性分别为97.21%(RNA1)和95.12%(RNA2)。通过对目前已报道的共14个分离物的基因组不同部分的分析,表明5'UTR是WYMV基因组变化幅度最大的区域,而编码区(ORF)及3'UTR的序列一致性较高且变动幅度小。另外,发现LYJN RNA2的5'UTR与已报道的所有分离物RNA2的核苷酸一致率仅为90%左右。综合分析RNA1和RNA2的系统发生树,表明WYMV各基因组片段呈单独进化特征,不同分离物间存在RNA重排。RNA重组分析显示在LYJN RNA1和TADWK RNA2发现了RNA重组。此研究说明WYMV在山东地区存在分离物分化现象,WYMV的5'UTR是基因组中的突变热点。     

潍坊萝卜红心病病原鉴定

 本文用生物学、血清学和分子生物学证据证明,引起潍坊萝卜红心病的病原为芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV).该病毒可系统侵染曼陀罗、油菜、咸阳黄瓜、丝瓜、大白菜和普通烟,局部侵染苋色藜和假酸浆,不侵染豌豆.病毒粒体弯曲线状,长约700 nm,可由蚜虫传播,在红心病组织内形成风轮状和片层凝集状内含体,它在SDS-琼脂糖凝胶免疫双扩散试验中可与TuMV的抗血清形成明显的沉淀线.该病毒的CP基因共867个核苷酸,编码288个氨基酸,分子量为32.98 kD.该序列与国内外20个TuMV分离物的CP氨基酸序列比较结果表明,这些分离物可以分为5组,其中引起萝卜红心病的病毒与日本的H1J、KYD8lJ、意大利的ITA7同属一组.     

多花黑麦草斑驳病毒基因组克隆与序列分析

 多花黑麦草斑驳病毒(Ryegrass mottle virus,RGMoV)属南方菜豆花叶病毒属,是牧草病毒病的重要病原。利用反转录技术合成和扩增了RGMoV RNA的cDNA。将cDNA克隆在载体pUC18上,对RGMoV的基因组RNA作序列分析。RGMoV RNA是一个正义单链RNA分子,全长4 210个核苷酸,包含4个开放阅读框架5'非翻译区包含99个核苷酸,3'非翻译区有198个核苷酸。RGMoV ORF的结构和南方菜豆花叶病毒以及水稻黄斑病毒的结构一样。ORF₁编码1个14.6 kD的蛋白质,这个蛋白质的功能还不清楚;ORF₂的产物由947个氨基酸组成,分子量为103.6 kD;ORF₃编码1个19.8 kD的蛋白质;ORF4编码1个25.6 kD的蛋白质,通过N末端氨基酸分析,确认ORF4为病毒外壳蛋白。RGMoV RNA的全序列以及染色体结构已被GenBank登录,登录号分别为AB040446和NC_003747。     

白草花叶病毒承德玉米分离物3′-cDNA 片段序列分析

 采自河北承德11 个表现矮花叶症状的玉米样品,用甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)和白草花叶病毒
(Pennisetum mosaic virus, PenMV)简并引物扩增了基因组3′ 端约2. 1 kb 的片段并进行测序。Blast 结果表明其中8 个样
品含有PenMV。扩增到的PenMV 序列均为2 135 nt,包括部分NIb 基因(985 nt)、完整的CP 基因(909 nt)和3′-UTR(241
nt)。这8 个分离物CP 基因和3′-UTR 与GenBank 上其他PenMV 分离物相应序列的核苷酸一致率分别为89. 8% ~ 93． 4%
和95. 9% ~ 97. 9% 。根据扩增的2 135 nt 序列和CP 基因序列构建系统发育树,8 个分离物与GenBank 上其他PenMV 分离
物都分为2 个组:山西组和承德组。重组分析表明CD9 的CP 基因存在重组。     

藜草花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与RT-PCR检测

 The nucleotide sequence of coat protein (cp)gene of Sowbane mosaic virus (SoMV)was determined. The cp gene of SoMV consists of 726 nucleotides and encodes a putative protein of 241 amino acid re-sidues. Sequence comparison showed that SoMV was most closely related to Rubus chlorotic mottle virus compared to other sobemoviruses. A primer pair was designed for the detection of SoMV based upon the determined cp nucleotide sequence. An expected fragment with 510 bp could be obtained from SoMV, while no specific band was observed from the healthy control. The result showed that the RT-PCR assay with the primer pair was suitable for the specific detection of SoMV.     

Variation in the pathogenicity of two Turnip mosaic virus isolates in wild UK Brassica rapa provenances

Brassica rapa can be infected with Turnip mosaic virus (TuMV) as a result of manual inoculation or aphid transmission, but infected plants have not been found in the field. In this study, B. rapa plants grown from seed collected from two field sites in southern England were mechanically inoculated with one of two distinct isolates (pathotypes) of TuMV under glasshouse conditions. These had either been isolated from Brassica oleracea growing wild in Wales, (GBR 83, pathotype 3) or Dorset (GBR 98, pathotype 1). Use of ELISA as an index of infection in manually inoculated B. rapa showed that although seed provenance had a small effect on the proportion of plants infected, the biggest factor was the virus isolate. Both virus isolates infected both lines of B. rapa , but invaded at different rates, although both resulted in easily discernible symptoms. The severity of symptoms was not related to amounts of virus in the infected plants. A significantly greater proportion of plants were infected with GBR 83 at 45 days post-inoculation (d.p.i.) than GBR 98. but GBR 98 caused significantly more severe and obvious symptoms as well as greater mortality at 119 d.p.i., in plants from both sites than GBR 83.     

大麦条纹花叶病毒中国株CP基因克隆分析、原核表达及抗血清制备

 首次用PCR方法,自大麦条纹花叶病毒中国株(BSMV-CH)的RNA₂(GenBank登录号为:AY789694,未报道)中扩增出外壳蛋白(coat protein,CP)基因,并亚克隆到pMD18-T载体上进行测序分析。结果表明BSMV-CH的CP全长597bp,它与BSMV其它株系CP的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.1%~93.8%和91.4%~92.4%;与同属的早熟禾半潜病毒(PSLV)和剪秋罗环斑病毒(LRSV)的核苷酸同源性分别为53.0%和41.8%,氨基酸同源性分别为48.1%和40.0%。根据大麦病毒属病毒已经报道的CP氨基酸序列绘制系统发育树,分析表明分离的各毒株在进化上存在明显地理位置的相关性。把CP基因亚克隆到GST融合表达载体pEGX-6p-1上,优化IPTG诱导终浓度后,在37℃ IPTG终浓度为1.0mmol/L时,融合蛋白GST-CP在大肠杆菌BL21中得到了特异表达。12% SDS-PAGE表明,表达产物大小为48.5kDa,主要以包含体形式存在。对蛋白进行定量后,用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗原,免疫家兔得到抗血清,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的抗血清效价为1/6 400。用抗血清对感病大麦和健康大麦进行检测,结果表明抗血清有很高特异性。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。