Detection of tobacco rattle virus by ELISA and test plants in main sprouts of tulip bulbs during storage at different temperatures

The detectability of tobacco rattle virus (TRV) in the main sprouts of primarily and secondarily infected tulip bulbs of cv. Apeldoorn stored at different temperatures from the lifting in July up to February is described. Detection by ELISA was not affected by the size of the main sprout, nor by the size of the bulbs. The rates of TRV-infected bulbs found by ELISA were highest during storage at 13, 9 or 5°C continuously, and when temperatures were lowered from 20 or 17°C to 5°C in October. The percentages detected via test plants, but undetectable by ELISA were also lowest at these temperatures. The unfavourable effect of continuous storage at 20, 17, or 2°C as expressed in low ELISA absorbances not significantly different from the mean value of healthy bulbs, was largely overcome during long storage by the change of temperature down to 5°C from 20 and 17°C or upwards from 2°C. The reverse from 5°C upwards to 17 and 20°C affected the detectability by ELISA unfavourably. The rate of detection via test plants in the main sprout and in the small sprouts from different positions in bulbs was only possible at low percentages.The effect of some factors, like different temperatures during storage, detectability of different TRV serotypes, interference of irregular occurrence of TRV in the removed scale and basal-plate tissue with the main sprout, and variable recurrence of TRV in progeny bulbs, is discussed in view of its impact on routine testing of bulbs during storage.     

Detection of tobacco rattle virus in nematodes by reverse transcription and polymerase chain reaction

An assay, based on amplification of cDNA synthesized from genomic viral RNA, has been developed to detect tobacco rattle virus in infected plant material and viruliferous nematodes. A range of different TRV strains could be detected using the procedure developed. The presence of one to three viruliferous nematodes in a nematode suspension was sufficient for the detection of TRV. The minimum amount of purified virus detectable in the assay was 15 fg, indicating an increased sensitivity of the PCR-based assay as compared to serological detection methods, like ELISA. A dot-blot hybridization procedure was developed for the detection of the PCR products, making agarose gel electrophoresis dispensable.     

Line pattern in Limonium latifolium caused by tobacco rattle virus

Tobacco rattle virus (TRV) was isolated from plants ofLimonium latifolium showing bright yellow or red line patterns and ringspots on the leaves. It was proved that this virus, designated TRV-Lim, was the causal agent of the disease. In its reactions onNicotiana clevelandii it resembled a yellow strain of TRV from Oregon (USA), but the symptoms inN. glutinosa, N. megalosiphon, N. tabacum andPetunia hybrida were more comparable to those caused by socalled unstable variants of TRV. Dilution end-point was 10^–6–10^–7, thermal inactivation at 76–80°C, and ageing in vitro 55–60 days. The purified virus suspension contained particles of three normal lengths, 70, 102, and 194 nm. The virus sedimented as three components with average sedimentation coefficients of 129, 161 and 206 S, respectively. In purified suspensions TRV-Lim had two different buoyant densities. A serological relationship was found with TRV isolated from Europe and Brazil.Samenvatting Tabaksratelvirus (TRV) werd geïsoleerd uitLimonium latifolium planten die heldergeel of rood figuurbont op de bladeren vertoonden. Er werd aangetoond dat dit virus, aangeduid als TRV-Lim, de ziekteverwekker was. De reacties van dit virus opNicotiana clevelandii deden denken aan die van een gele stam van TRV afkomstig uit Oregon (VS), maar de symptomen opN. glutinosa, N. megalosiphon, N. tabacum enPetunia hybrida vertoonden meer gelijkenis met die welke veroorzaakt worden door de zogenaamde onstabiele varianten van TRV. De verdunningsgrens was 10^–6–10^–7, de inactiveringstemperatuur 75–80°C en de houdbaarheid in vitro 55–60 dagen. De gezuiverde virussuspensie bevatte deeltjes met drie normale lengtes, nl. 70, 102 en 194 nm. Het virus sedimenteerde, als drie componenten met gemiddelde sedimentatiecoëfficiënten van respectievelijk 129, 161 en 206 S. In gezuiverde suspensie vertoonde TRV-Lim twee verschillende zweefdichtheden. Het virus was serologisch verwant aan TRV-isolaten uit Europa en Brazilië.     

Purification of tulip breaking virus and production of anti-sera for use in ELISA

After comparison of various homogenization buffers and clarification methods, tulip breaking virus (TBV) was purified on a large scale by homogenization in 0.1 M tris buffer (pH 9.0), clarification with Triton X-100, and differential centrifugation. The TBV suspensions were absorbed with an anti-host protein antiserum. The purity of the product was verified by mechanical inoculation of test plants, serology, electron microscopy, spectrophotometry, and analytical ultracentrifugation.The TBV antisera obtained from rabbits after intramuscular injections had titres of 1/1280 to 1/10240 in the microprecipitin test and were mainly used in conjugate dilutions of 1/1000 in ELISA. The absorbance values for healthy tulips and lilies were (very) low. The antisera prepared against TBV from tulip cv. Jack Laan reacted best with TBV in lilies, whereas the antisera prepared against TBV from tulip cv. Texas Flame reacted best with TBV in tulips.Samenvatting Na vergelijking van verschillende homogenisatie-buffers en klaringsmethoden werd het tulpemozaïekvirus (TBV) op grote schaal gezuiverd door gebruik te maken van 0,1 M tris-buffers (pH 9,0), klaring met Triton X-100 en differentieel centrifugeren. De virussuspensies werden geabsorbeerd met antiserum gemaakt tegen plante-eiwitten. De zuiverheid van het produkt werd vastgesteld door mechanische inoculatie van toetsplanten, serologie, elektronenmicroscopie, spectrofotometrie en analytische ultracentrifugering. De TBV-antisera, verkregen na intramusculaire injecties van konijnen, hadden titers van 1/1280 tot 1/10240 in de microprecipitatietoets en werden in ELISA meestal in conjugaatverdunningen van 1/1000 gebruikt. De absorptiewaarden met gezonde tulpen en lelies waren (zeer) laag. De antisera bereid tegen TBV uit de tulpecultivar Jack Laan reageerden het best met TBV in lelies en de antisera tegen TBV uit de tulpecultivar Texas Flame het best met TBV in tulpen.     

Acquisition and subsequent transmission of tobacco rattle virus isolates by Paratrichodorus and Trichodorus nematode species

Isolates of the PRN serotype of tobacco rattle virus (TRV) were transmitted with different efficiencies by the nematode vectorParatrichodorus pachydermus. Virus isolates which belonged to other serotypes were not acquired and/or transmitted by this vector, nor were PRN serotype isolates which had been obtained from naturally infected potato plants and maintained by mechanical transmission in the glasshouse for several years. PRN serotype TRV isolates from the Netherlands or from Scotland were equally well transmitted by initially virus-freeP. pachydermus populations from either country. Allowing a naturally viruliferous nematode population access for 3 weeks to uninfected or TRV-infected roots resulted in an increased proportion of the trichodorid population transmitting TRV.     

Notched leaf inGladiolus spp., caused by viruses of the tobacco rattle virus group

Symptoms of notched leaf in gladiolus are described in this paper. The disease can occur either in patches in the field (only on sandy or light sandy loam soils) or in plants scattered throughout a field planted with a certain stock (independent of soil type). Experiments showed that this disease is caused by tobacco rattle virus (TRV), which is transmitted byTrichodorus pachydermus Seinhorst andT. similis Seinhorst. Gladiolus corms planted in infested soil show a more or less serious reduction of growth and sometimes typical symptoms of notched leaf. In experiments these notched leaf symptoms could be reproduced in the first season only whenTrichodorus from infested soil was able to infect the young sprouts on top of the corms. If infection took place through the roots, the growth of the plants was not or only slightly retarded and the typical notched leaf symptoms appeared in the offspring in the following season. At least two serologically different strains of TRV could be isolated from affected gladiolus. These serotypes were not found to be typical for a certain location as in some cases both were isolated from the same infested field. In fields where potatoes showed stem-mottle and/or spraing, gladiolus was affected by notched leaf.Samenvatting Kartelblad in gladiolen kenmerkt zich door slecht uitgegroeide, misvormde planten, waarbij langs de randen en de nerven van de bladeren necrotische strepen en karakteristieke kartel- en zaagranden optreden (fig. 1). De planten komen meestal niet tot bloei. Alle overgangen tussen normale planten en die met de beschreven symptomen komen voor.In de knollen en kralen van de aangetaste planten zijn geen kenmerkende symptomen waar te nemen. In het gewas te velde kunnen deze aangetaste planten, in variërende percentages, verspreid tussen de gezonde planten van een partij voorkomen, terwijl aangrenzende partijen geheel gezond kunnen zijn. In deze gevallen, die op alle grondsoorten worden aangetroffen, is de partij één of meer seizoenen eerder geïnfecteerd. In andere gevallen worden planten als zojuist beschreven pleksgewijs in het gewas aangetroffen (fig. 2). Dergelijke aantastingen komen uitsluitend voor op de lichtere gronden en hierbij wordt eveneens een abnormale ontwikkeling van het wortelstelsel waargenomen (fig. 3).In proeven kon worden aangetoond dat de ziekte veroorzaakt wordt door virussen van de ratelvirusgroep (zie tabel 1 tot en met 6). In de grond aanwezige aaltjes van het geslachtTrichodorus (T. pachydermus Seinhorst,T. similis Seinhorst en mogelijk nog andere soorten) brachten het virus op de waardplant over (tabellen 2, 5 en 6).In het seizoen waarin infectie plaatsvond, ontstonden uitsluitend kenmerkende kartelblad-symptomen indien aaltjes, afkomstig van besmette grond, de mogelijkheid werd gegeven jonge, nauwelijks uitgegroeide spruiten aan te tasten (fig. 5, tabel 6). Infectie in de wortels veroorzaakt geen of slechts een geringe groeistoornis, maar in de nakomelingschap van deze planten komen in het volgende seizoen de typische symptomen van kartelblad voor (fig. 4, tabel 3, 5 en 6).Op een aantal gronden waar aardappelen waren geïnfecteerd door stengelbont of kringerigheid, werden gladiolen door kartelblad aangetast. In proeven waar gladiolen en aardappelen door TRV op dezelfde percelen waren geïnfecteerd, bleek een opmerkelijke overeenkomst in het verloop van kartelbladaantasting bij gladiolen en stengelbontaantasting bij aardappelen te bestaan (tabel 4).Bij het onderzoek van verschillende TRV-isolaties uit gladiolen met kartelblad-symptomen en uit andere waardplanten die afkomstig waren van met TRV enTrichodorus sp. besmette gronden, konden tenminste twee verschillende serotypen van het TRV worden aangetoond. Isolaties van het ene serotype bleken nauw verwant te zijn met een TRV-isolatie uit tabak White Burley, waartegen een antiserum is vervaardigd doorMaat (1963). Vertegenwoordigers van het andere serotype reageerden alle serologisch positief met een antiserum bereid tegen een TRV-isolatie uit gladiool. Beide serotypen bleken niet specifiek te zijn voor bepaalde plaatsen, daar beide verspreid door het land blijken voor te komen en in sommige gevallen uit eenzelfde perceel konden worden geïsoleerd. In een volgende publikatie zal hierop nader worden ingegaan.A preliminary report on this subject has been published in Nematologica 10 (1964):69–70.     

Detection of potato virus Y in early-harvested potato tubers by cDNA hybridization and three modifications of ELISA1

The standard ELISA method for detection of PVY in dormant potato tubers was compared with recently developed methods: (1) a hybridization technique, using a complementary DNA-probe to PVY^N; (2) three modifications of ELISA (standard monoclonal, Flegg & Clark polyclonal or monoclonal). Sap of six Dutch cultivars secondarily infected with PVY was subjected to these methods directly after lifting and after six subsequent one-week intervals during storage at 20°C. During storage the detectability of PVY decreased, irrespective of the diagnostic method applied. However, decrease was less in susceptible than in resistant cultivars. Although the hybridization technique yielded slightly better results than the standard ELISA procedure, it was time-consuming and involved hazardous reagents. The modifications of ELISA investigated were not, in general, more sensitive than standard ELISA.     

Winter-type california tobacco rattle virus in its relation to the infected cell

Particles of California tobacco rattle virus (CTRV) were observed in thin sections of vascular elements of leaves showing oak leaf symptoms. At no time during this study were particles observed in mesophyl cells of these leaves. A peculiar chloroplast breakdown is described.     

检测兰花病毒的斑点酶联法的建立

本文建立了齿兰环斑病毒（Odntoglossum ringspot virus,ORSV）和建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）两种兰花主要病毒的斑点酶联法检测技术（Dot-ELISA）。用Dot-ELISA对提纯病毒和田间病叶进行检测,结果表明;检测ORSV和CyMV提纯病毒的灵敏度分别为0.82μg/mL和0.244μg/mL;病叶汁液的稀释倍数分别为1280倍和2650倍。该方法具有操作简便、成本低等优点,适合于兰花生产中的病毒检测。     

Separation of long and short particles of tobacco rattle virus with polyethylene glycol

Two methods to separate long and short particles of tobacco rattle virus with polyethylene glycol 6,000 (PEG) are described. The first is based on specific precipitation, the second on specific solubilization of particles with different lengths at different PEG concentrations. The results of the separations are comparable to, or better than those obtained by sucrose-gradient centrifuging. The advantage of the methods using PEG is that no expensive equipment is required.Samenvatting Twee methoden om lange en korte deeltjes van het tabaksratelvirus met behulp van polyethyleenglycol 6000 (PEG) te scheiden worden beschreven. De ene is gebaseerd op specifieke precipitatie, de andere op specifieke oplosbaarheid van deeltjes met verschillende lengten bij verschillende PEG-concentraties. De resultaten van de scheidingen zijn even goed als of beter dan die van scheidingen verkregen door centrifugeringen op een suikergradiënt. Het voordeel van de PEG-methoden is gelegen in het feit dat er geen kostbare apparatuur voor nodig is.     

运用一步法RT-PCR检测柑橘鳞皮病毒及其在橘橙不同部位中的全年分布

2005年5月到2006年4月逐月采样,运用一步法RT-PCR检测Citrus psorosis virus(CPV)在Dweet橘橙苗木叶片和枝皮中的分布。保存在控温温室中的Dweet橘橙病株中老叶、老皮、嫩叶和嫩皮全年都可以检测出CPV;保存在网室中的Dweet橘橙病株中老叶、老皮全年均能检测到CPV,而夏梢的嫩叶、嫩皮不能稳定地检测出CPV,春、秋梢的嫩叶、嫩皮均可检测到CPV,表明一步法RT-PCR检测CPV最佳取样部位为老叶和老皮。     

Viruses of the tobacco rattle virus group in Northern Italy: Their vectors and serological relationships

Four species ofTrichodorus have been found in northern Italy, viz.Trichodorus viruliferus, T. teres, T. nanus and an undescribed species. In seven cases tobacco rattle virus (TRV) was isolated from soil samples by means of bait seedlings and in three of these cases the vector was found to beT. viruliferus. The seven virus isolates reacted with an antiserum against a Dutch TRV isolate and were divided into two groups according to their reaction with this serum. One isolate from each group was subjected to a more detailed examination. Of these, one was found to be closely related to a Dutch isolate from gladiolus with notched leaf symptoms, while the other showed a distinct relationship to the pea early-browning virus found in Britain. One of the isolates proved to be more closely related to the Dutch TRV than is the Dutch gladiolus isolate.     

Transmission of rattle virus andAtropa belladonna mosaic virus by nematodes

Samenvatting Met ratelvirus en mozaïekvirus vanAtropa belladonna, twee op elkaar gelijkende grondvirussen, werden proeven gedaan over een mogelijke overbrenging door aaltjes.Nematoden uit met virus besmette grond werden toegevoegd aan natuurlijke, onbesmette grond, aan tot 60°C of 120°C verhitte en aan gewreven grond. Door wrijven van de grond worden de meeste aaltjes en andere organismen van dezelfde afmetingen gedood. In de aldus behandelde en geïnoculeerde grond werden tabaksplanten geteeld. Bij de proeven met mozaïekvirus vanAtropa belladonna werden tien dagen na het planten de wortels uitgeperst en het sap met carborundum uitgewreven op bladeren van gezonde tabaksplanten. Bij de proeven met ratelvirus werd dit alleen gedaan met planten, die dertig dagen na het planten geen symptomen vertoonden.Virusinfectie trad niet op in de proeven, waar aaltjes niet de overbrengers konden zijn. Aaltjes uit besmette grond brachten in zeer veel gevallen virus naar onbesmette grond over (tabellen 1 en 2). Hoplolaimus uniformis enHemicycliophora sp. brengen het ratelvirus waarschijnlijk niet over. De proeven worden voortgezet met andere soorten aaltjes.     

Tobacco rattle tobravirus: variation among strains and detection by cDNA probes1

Because of their extreme antigenic variability, only a small proportion of tobacco rattle tobravirus isolates will be detected in serological tests with a single antiserum. Moreover, serological tests will not detect NM-type isolates that do not produce coat protein, and would misidentify some natural recombinant isolates as pea early-browning tobravirus. In contrast, nucleic acid hybridization tests with a probe to any part of RNA1 can detect all these different variants of tobacco rattle tobravirus.     

南芥菜花叶病毒RT-PCR扩增产物胶体金层析和酶联检测方法的建立

南芥菜花叶病毒是我国进境植物检疫性有害生物,为建立快速灵敏的检疫检测方法,本研究用生物素标记一条引物,用荧光素(或地高辛)标记另一条引物,经RT-PCR扩增产生双标记的扩增产物,建立了PCR扩增产物的胶体金层析检测和ELISA检测方法。胶体金层析检测方法在15min即可获得检测结果,ELISA方法需20h,后者检测的灵敏度可比前者分别提高100倍和5000倍。所建立的2种方法都免去了普通PCR检测的溴化乙锭染色和电泳的过程。     

Detection of beet yellows virus in sugarbeet plants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Beet yellows virus can be detected in leaf extracts of infected sugarbeet plants by ELISA. The use of discs was studied and proved to be a valuable and qualitatively reliable method. Leaf material could be stored at 4^o or 22°C for at least six days without affecting the detection of this virus by ELISA. A dramatic decrease in ELISA values was found when leaf extracts were frozen.In an analysis of the distribution of virus over the plant it was found that young leaves present at the moment of infection and those which had still to develop after infection will contain virus. Symptoms produced by systemic virus invasion occur on the oldest leaves containing virus.Samenvatting Het bietevergelingsvirus kan op betrouwbare wijze met de ELISA methode in geïnfecteerde bieteplanten worden aangetoond. Een aanzienlijke vereenvoudiging van de procedure kan worden bereikt met de zogenaamde disc-method, waarbij intacte ponsstukjes in de putjes van de ELISA-plaat worden geïncubeerd. Hierbij komt voldoende virus uit de ponsstukjes voor ELISA vrij. Bladmateriaal kon op verschillende wijzen bewaard worden zonder dat de mogelijkheid om het virus aan te tonen achteruitging. Met bladextracten die ingevroren waren, werden echter slechte resultaten verkregen.In een analyse naar de verdeling van het virus over het loof bleek het virus voor te komen in de geïnoculeerde bladeren, in die bladeren die op het tijdstip van inoculatie minder dan de helft van hun uiteindelijke lengte bereikt hadden en in de bladeren die nog moesten verschijnen. De symptomen ontwikkelden zich op de oudste systemisch geïnfecteerde bladeren.