烟草环斑病毒RT-Realtime PCR检测方法

烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)是我国公布的二类检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。受该病毒侵染的一些寄主植物出现隐症,并伴随病毒浓度降低,给检测工作造成困难。根据TRSV外壳蛋白基因序列设计合成了一对引物及一条MGB探针,优化了反应条件,建立了TRSV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与常规的DAS-ELISA方法和RT-PCR方法相比,灵敏度分别提高了200倍和4倍,并且对不同寄主上的TRSV均有较好的检测效果。     

胶体金免疫层析法快速检测烟草环斑病毒

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒 ,标记烟草环斑病毒的抗体 ,制成免疫层析检测试纸条。检测粗提纯病毒的灵敏度为 1 0 0 0ng/ml,病汁液稀释 1 0 0 0倍后仍可快速检出。对大豆病种子、烟草冻干病叶等不同材料进行检测也有良好的效果 ,1～ 2min即可出现结果。用 9种不同的病毒进行测试 ,未出现非特异性反应。     

烟草环斑病毒的检疫检测方法

通过研究,提出了烟草环斑病毒的血清学,生物学,等检测方法,初步建立了一套烟草环斑病毒的检测程序。     

A蛋白斑点免疫金染色和双抗体夹心酶联检测齿兰环斑病毒的比较

A蛋白斑点免疫金染色检测齿兰环斑病毒提纯病毒的灵敏度为1.56 ng/μl,检测病汁液的稀释倍数为640倍.同时采用碱性磷酸酯酶标记抗体IgG.IgG包被酶联板的浓度为1 μg/ml,酶标抗体以1 /1000稀释使用.DAS-ELISA技术检测ORSV提纯病毒的灵敏度为0.048 ng/μl,检测病汁液的稀释倍数为20480倍.     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒

根据番茄环斑病毒和烟草环斑病毒各分离物CP基因的保守序列分别设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,分别建立了ToRSV和TRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,在口岸病害检疫中具有广泛的应用前景。     

侵染唐菖蒲的烟草环斑病毒的研究

 1987年3月,从荷兰引进的唐菖蒲球茎,在Saxany品种上,选取症状为斑驳的病株,经鉴定是烟草环斑病毒侵害的结果。通过病毒寄主范围的测定、它可侵染豆科、茄科、藜科、葫芦科、番杏科中的17种植物。摩擦接种在菜豆"Pinto"、"家雀旦";豇豆"黑种三尺","黑眼",按种叶出现局部坏死斑,系统生长点坏死。大豆"猴子毛","晋豆84"局部坏死斑,顶枯。在苋色藜及昆诺阿藜上,接种叶局部坏死斑,无系统症状。普通烟White Buriey,接种叶局部退绿环斑,系统退绿环斑和橡叶。
番杏、二青黄瓜接种叶局部退绿斑,系统花叶。
病毒的致死温度为65℃,稀释终点10-⁴,体外存活期6-7天(室温)。病毒粒体为等轴对称,直径约28nm。琼脂双扩散其沉淀线与标准的TRSV沉淀线完全相接,说明其抗原性相同。病毒外壳蛋白由一种蛋白亚基构成,分子量约58000道尔顿。     

RT—PCR检测烟草环斑病毒的研究

本文报道应用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ）的。根据ＴＲＳＶＲＮＡ－２序列３末端非编码区设计，合成引物－１和引物－２；用ＴＲＳＶＲＮＡ作模板，引物－２作引物，反转录合成ｃＤＮＡ，并以此作模板进行ＰＣＲ扩增，５－６小时内可得到结果，检测粗提液中ＲＮＡ灵敏度达４００ｐｇ，并且可以直接从受侵染的叶片汁液中检出ＴＲＳＶ，为口岸快速检测疫推出一个更灵敏、准确的分子生物学新方法。值得推广应用。     

侵染月季的李坏死环斑病毒的检测及CP基因序列分析

近年来，随着我国切花月季（Rosa hybrid）种植面积的不断增加，月季病毒病的发生日趋严重。据笔者调查，平均发病率20％～30％，有的品种如“绿宝石”，发病率超过60％。李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV）是月季的主要病毒之一。国内对月季病毒病的研究较少。为明确我国切花月季的主要病毒种类，加强对月季种苗质量的监督检测，笔者对侵染月季的PNRSV云南分离物（PNRSV—yunnan）进行了CP基因克隆及序列分析，建立了快速RT—PCR检测技术。     

实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒

 根据番茄环斑病毒(ToRSV)各株系RNA1聚合酶基因的保守序列,设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了对ToRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现RT-PCR扩增与探针检测同时进行,不需PCR后处理,消除了PCR产物的污染,不需电泳和EB染色,减少了检测步骤,节省了时间。这个方法具有"灵敏、准确、简便、快速"的特点适合于种传病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

广东省国兰病毒病害调查及CymMV和ORSV基于cp基因的系统进化分析

为调查广东省国兰病毒病发生情况,采用双抗体夹心-酶联免疫吸附测定(double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)法对采集自广州市、汕头市和韶关市兰花主产区的53份具有典型病毒病症状的国兰叶片进行检测,选取35份病叶应用RT-PCR技术对检测结果进行验证,并基于cp基因序列对检测到的病毒进行系统进化分析。DAS-ELISA检测结果显示,53份病叶中有44份检出病毒,总检出率为83.02%;其中,有14份仅检出建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV),有19份仅检出齿兰环斑病毒(Odontolossum ring spot virus,ORSV),有11份检出CymMV和ORSV复合侵染,检出率分别为26.42%、35.85%和20.75%。RT-PCR检测结果显示,35份病叶中有30份检出病毒,总检出率为85.71%;其中,有21份仅检出CymMV,有6份仅检出ORSV,有4份检出CymMV和ORSV复合侵染,检出率分别为60.00%、17.14%和11.43%,但未检测到其它病毒。表明广东省国兰病毒病害主要由CymMV和ORSV侵染引起。序列和系统进化分析显示,来源于不同地区和寄主的CymMV和ORSV分离物的cp基因序列极为保守,CP氨基酸序列相似性分别大于97.31%和93.67%,且CymMV和ORSV多样性种群的分化与寄主种属和地理隔离关系不大。     

烟草赤星病危害烤烟产量产值损失测定

在烤烟生长中后期 ,应用40%菌核净500倍液人为控制烟草赤星病发生程度 ,形成不同危害梯度 ,以研究烟草赤星病对产量产值的影响。经试验分析 ,建立数学模型。中上等烟产量损失率(Y₁)与病情指数(X)的关系式:Y₁=0.1516+1.2824X;产值损失率(Y₂)与病情指数(X)的关系式:Y₂=0.3239+0.9831X。     

烟草赤星病防治研究进展

在烟草赤星病综合防治研究中 ,国内外对烟草进行了诱导寄主抗病性、生物防治、化学药剂防治、转基因抗病育种等方面的研究。本文综述了近年烟草赤星病综合防治的研究成果 ,提出利用生物技术获得抗病品种 ,及采用生物防治、诱导抗病性进行烟草赤星病综合治理     

广东西瓜上检测到甜瓜黄斑病毒

在广东发现了可能被番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒侵染的西瓜,采用ELISA和RT-PCR法对该西瓜病样进行了检测,西瓜病叶粗汁液不与番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)的血清发生反应;利用引物J13/UHP通过RT-PCR可以扩增出约1400 bp的基因片段,该片段包括一个840 bp的核衣壳蛋白ORF,其推导的氨基酸序列与已报道的Melon yellow spot virus(MYSV)NP基因氨基酸序列的同源率都为99%,进化树分析表明侵染广东西瓜的病毒(命名为MYSV-GZ)属于Tospovirus的MYSV血清组。     

侵染云南烟草的番茄环纹斑点病毒N基因的分子变异分析

 应用电镜观察和ELISA检测从云南11个县（市）烟草种植区采集的烟草上检测到番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus, TZSV）。根据TZSV N基因设计引物扩增得到了31个TZSV分离物N基因全序列。测序分析表明,31个TZSV N基因核苷酸序列与GenBank中报道的序列相似性在94.9%~98%之间,其推导的氨基酸序列同源性为98.2%~99.3%。构建系统进化树发现云南不同地区的TZSV分离物存在一定差异。氨基酸序列比较发现,文山分离物和西畴分离物具有2个该地区独有的氨基酸位点。     

防治烟草赤星病拮抗根际芽孢杆菌的筛选

 从健康烟草根分离到669株根际芽孢杆菌,通过平板对峙培养、代谢产物活性检测,筛选到9株抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)活性较强的菌株,其菌体及粗代谢产物产生的抑菌圈直径均在10 mm以上;离体防效和田间小区防治试验表明,菌株B6、B75的含菌发酵液和粗代谢产物的离体防效分别为75.6%、76.9%和62.5%、64.7%,小区防效分别为70.3%、75.8%和60.3%、64.4%。粗代谢产物的抑菌作用试验发现,菌株B75的粗代谢产物在一定浓度范围内均能抑制赤星病菌孢子萌发、菌丝生长与产孢。