不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞（PGCs）传代培养的影响，将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养，即A组：基础液＋10ng／mL白血病抑制因子（LIF）＋10ng／mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；B组：基础液＋20ng／mL LIF＋20ng／mL bFGF；C组：基础液＋20ng／mL LIF＋10ng／mL bFGF；D组：基础液＋20ng／mL LIF；E组：基础液＋20ng／mL LIF＋20ng／mL bFGF＋20ng／mL干细胞因子（SCF）；F组：基础液＋20ng／mL LIF＋40ng／mL bFGF＋40ng／mL SCF；G组（对照组）：基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞（BEF）饲养层上进行传代培养。结果，原代时，A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组（P％0．05），其中E和F组的克隆数目显著高于A组（P〈0．05），而与B、C、D组差异均不显著（P〉0．05）；1～8代时，B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组（P〈0．05）；对照组传代数仅为2代，A组为5代，而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明，在传代过程中，LIF起主要作用，20ng／mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。     

鸡胚原始生殖细胞(PGCs)玻璃化冷冻的研究

对发育至第19期和第28期鸡胚性腺原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），用6种玻璃化冷冻液1：10％DMS0＋10％EG＋10％PVP，Ⅱ：20％EG＋10％PVP，Ⅲ：20％DMSO＋10％PVP，Ⅳ：10％DMSO＋10％EG＋0．5mol／L Surcose，Ⅴ：20％EG＋0．5mol／LSurcose，Ⅵ：20％DMSO＋0．5mol／L Surcose进行冷冻保存。结果：第19期鸡胚PGCs玻璃化冷冻复苏后存活率，在冷冻液Ⅱ与Ⅳ之间差异不显著（P〉0．05），Ⅴ与Ⅵ之间差异显著（P〈0．05），其余各冷冻液之间差异均极显著（P〈0．01）。第28期鸡胚PGCs玻璃化冷冻复苏后存活率，在冷冻液Ⅳ与Ⅴ之间差异显著（P〈0．05），Ⅲ与Ⅳ、Ⅴ之间差异不显著（P〉0．05），Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ之间差异不显著（P〉0．05），其余各玻璃化冷冻液之间差异均极显著（P〈0．01）。复苏后接种培养传至第2代的鸡胚PGCs细胞，PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。     

不同冷冻剂对鸡胚PGCs的保护效应

发育至第19期和第28期的鸡胚性腺原始生殖细胞（PGCs）分离提纯后，在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖进行超低温冷冻保存，比较冷冻保护剂在单独或联合使用条件下对PGCs的冷冻保护效果，复苏后台盼蓝染色测定细胞存活率，体外接种培养、传代。结果表明：（1）第19期PGCs冷冻保存中，10％EG＋10％FBS＋0．1mol／L。蔗糖条件下细胞存活率最高为（92．20±2．18）％，且与10％DMSO＋10％FBS的存活率差异显著（P〈0．05），其余各冷冻保护液间存活率差异不显著；第28期PGCs冷冻保存中，5％DMsO＋5％EG＋10％FBS＋0．1mol／L。蔗糖条件下细胞存活率最高为（92．41±2．82）％，但各冷冻保护液间存活率差异均不显著（P〉0．05）。（2）解冻后体外培养的PGCs，在饲养层和3种细胞因子（I。IF、SCF、bFGF）的共同作用下，可持续增殖，传至第3代的PGCs，PAS染色、AKP染色均呈阳性并保持完整的二倍体核型，仍处于未分化状态。     

山羊原始生殖细胞分离与培养的影响因素

以本地白山羊胎儿的生殖嵴为试验材料,从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中分离培养得到胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs),对其进行体外培养和鉴定等。胎儿生殖嵴在室温(25℃)下消化15 min,使用0.125%胰酶+0.02%EDTA比0.25%胰酶+0.04%EDTA效果好,差异显著(P<0.05);挑取集落法和胰酶消化法均能将PGCs传至第2代,两种方法差异不显著(P>0.05);以GEF为饲养层,在培养液中添加不同浓度和种类的细胞因子:①LIF:10 ng/mL;②LIF:20 ng/mL;③LIF(10 ng/mL)+SCF(10 ng/mL);④LIF(20 ng/mL)+SCF(20 ng/mL)。4种情况对于原代集落形成率的影响差异不显著(P>0.05),均能得到传至第2代的EGCs;研究不同胎龄胎儿分离培养PGCs的效果,结果发现4例冠臀长小于15 mm的胎儿仅观察到一个原代集落,6例大于30 mm的胎儿没有观察到原代集落。     

鸡胚19期原始生殖细胞慢速冷冻和玻璃化冷冻保存的研究

本研究对发育至第19期的鸡胚性腺原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)分离提纯后，在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）分别组成6种慢速冷冻保护液和6种玻璃化冷冻保护液，进行超低温冷冻保存。复苏后苔盼蓝染色测定细胞存活率，体外接种培养、传代。结果：①慢速冷冻保存中，PGCs在慢速冷冻液V（10％EG+10% FBS+0.1 mol/L蔗糖）条件下复苏后存活率最高（92.20%），且与慢速冷冻液I（10％ DMSO+10% FBS）存活率之间差异显著（P<0.05）。②玻璃化冷冻保存中，PGCs在玻璃化冷冻液I（10% DMSO+10% EG+20% FBS+10% PVP）条件下复苏后存活率最高（84.15%），且与其余5种玻璃化冷冻液下复苏后存活率之间差异均极显著（P<0.01）。③培养传至第3代的慢速冷冻复苏后PGCs细胞和培养传至第2代的玻璃化冷冻复苏后PGCs细胞，PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。     

不同浓度表皮生长因子(EGF)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响

为了研究不同浓度表皮生长因子(EGF)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响,通过体外培养鸡胚盲肠上皮细胞,添加不同浓度表皮生长因子(EGF,0、10、20、30、40 ng/mL)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响,并对体外培养的鸡胚盲肠上皮细胞进行了碱性磷酸酶鉴定,细胞形态学观察贴壁率,测定生长曲线。结果显示:加入20 ng/mL的EGF,对鸡胚盲肠上皮细胞增殖的促进作用是极显著的(P0.01)。表明EGF作为重要的细胞因子之一,参与调节并促进鸡胚盲肠上皮细胞体外生长。     

鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养

旨在对影响鸡胚胎原始生殖细胞（PGCs）体外培养、传代过程的各种影响因素进行探讨。将分离到的19期鸡胚胎生殖腺的PGCs在以鸡胚成纤维细胞（CEF）为饲养层，添加细胞因子的培养体系中进行培养、传代。经冷冻保存的PGCs在添加细胞因子的培养体系中能增殖，并具有分化能力。从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定等方面对培养过程中的鸡胚胎PGCs进行检测。结果表明，采用传至3代的CEF为饲养层，多次离散法进行传代所获得的5代鸡胚胎PGCs不但能有效维持PGCs的未分化状态和正常二倍体核型，也具有其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

四氯联苯对鸡胚性腺原始生殖细胞的毒性影响

采用四氯联苯处理发育至Ⅹ期的白来航鸡种蛋,孵化5.5天后取出胚胎进行全固定,用石蜡切片和PAS染色(高碘酸希夫试剂)研究四氯联苯对鸡胚性腺原始生殖细胞(PGCs)的影响.结果表明,四氯联苯对发育至5.5日胚龄的鸡胚性腺PGCs数量和结构有明显影响,但雌二醇处理的5.5日胚龄鸡胚PGCs数量变化不显著,其结构无明显变化.表明四氯联苯对5.5日胚龄的鸡胚性腺PGCs的影响主要来自于其毒性作用.     

鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养

在鸡胚孵化48,50,54,56,60h的不同时期，分离血液中原始生殖细胞（PGCs)，分离前的浓度分别为0.011%,0.007%,0.006%,0.006%,0.004%,0.001%,分离后的浓度分别为0.245,1.21%,1.02%,0.64%,0.27%,孵化48－54h，血液中PGCs浓度差异不显著，但孵化48h的鸡胚液较少，PGCs绝对量较低。孵化52－54h的鸡胚血液量较大，获取PGCs的绝对值较高，故分离PGCs的时间以孵化52－54h为宜，鸡胚血液中PGCs在未中任何外源生长因子而含10％FCS的TCM－199培养基中体外培养，能够存活3－4d。     

LncRNA PGCT8正向调控鸡原始生殖细胞形成

研究旨在对前期测序筛选到的关键LncPGCT8对鸡原始生殖细胞（PGCs）形成的影响进行深入探究。试验通过qRT-PCR和组织表达谱分析LncPGCT8在鸡PGCs和生殖嵴中的表达量。在体内外过表达/干扰LncPGCT8，通过qRT-PCR、流式细胞术、间接免疫荧光和免疫组织化学染色检测体内外PGC形成效率。结果显示：LncPGCT8在鸡PGCs和性腺中均显著高表达（P<0.05），过表达LncPGCT8组PGCs形成效率显著高于对照组（P<0.05），干扰LncPGCT8则会显著降低PGCs形成数量（P<0.05）。结果表明LncPGCT8在体内/外均促进鸡PGCs形成，为提高体外诱导PGCs效率奠定理论基础。     

坝上长尾鸡原始生殖细胞的分离、培养与鉴定

为了研究坝上长尾鸡的原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs),试验分别从孵化至13~15期的坝上长尾鸡鸡胚血液和5.5 d的鸡胚生殖嵴中分离得到PGCs,接种于24孔培养板,以鸡胚成纤维细胞(CEF)为饲养层,添加细胞因子的培养体系,在温度37℃、95%空气和5%CO2培养箱中进行体外培养和传代,借助组织化学及免疫组织化学方法进行染色,并采用PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)以及SSEA-1等方法进行鉴定。结果表明:PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP以及SSEA-1染色呈阳性。     

5-Aza-CdR对德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育效果的影响

为了探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对德保黑猪手工克隆（HMC）重构胚胎体外发育效果的影响，本研究分别从供体细胞和重构胚入手，比较了5个不同处理浓度（0、5、10、20和40 nmol/L）5-Aza-CdR处理HMC重构胚的体外发育效果，筛选最佳处理浓度；在最佳浓度下比较5个不同处理时间（0、24、48、72和96 h）对HMC重构胚的体外发育效果，筛选最佳处理时间；用4个不同浓度（0、0.25、0.5和1 μmol/L）5-Aza-CdR结合最佳浓度和最佳时间处理供体和重构胚，比较其体外发育潜能。结果显示，与空白对照组相比，5、10、20和40 nmol/L 5-Aza-CdR处理72 h对重构胚卵裂率均无显著差异（P>0.05），20 nmol/L 5-Aza-CdR处理能显著提高重构胚的囊胚率（P<0.05），10和20 nmol/L 5-Aza-CdR处理均能显著提高囊胚细胞数（P<0.05），其中以20 nmol/L 5-Aza-CdR效果最佳；与空白对照组相比，利用20 nmol/L 5-Aza-CdR处理HMC重构胚72 h能显著提高重构胚的囊胚率和囊胚细胞数（P<0.05），其余处理时间对重构胚卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响（P>0.05）；在囊胚的最佳处理浓度（20 nmol/L）和最佳处理时间（72 h）下，结合供体的4个处理浓度（0、0.25、0.5和1 μmol/L），同时处理重构胚和供体，各处理组HMC重构胚的发育潜能均有提高，但效果均不显著（P>0.05），其中0.25~0.5 μmol/L 5-Aza-CdR处理效果较佳。综上表明，适宜浓度（0.25~0.5 μmol/L）的DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理供体细胞72 h并结合20 nmol/L 5-Aza-CdR处理重构胚72 h均能有效提高德保黑猪HMC重构胚胎的体外发育潜能，该结果可为今后研究德保黑猪HMC胚胎DNA甲基化调控机制提供参考。     

多氯联苯对鸡胚性腺发育的毒性和雌性激素作用

研究了内分泌干扰物多氯联苯 (PCB)对鸡胚性分化开始后性腺发育和配子分化的影响。在孵化的第 10天向气室内注入 Aroclor12 5 4或雌激素 ,第 19天取出睾丸和卵巢 ,进行形态学观察。结果显示 ,PCB明显促进卵巢皮质的发育 (P<0 .0 5 ) ,效果类似 17β-雌二醇 (E2 ) ;对睾丸发育也呈现微弱的雌激素样作用 ,生精细胞分化受到抑制 ,细精管管壁显著变薄 (P<0 .0 1) ,而 E2 作用于睾丸会导致睾丸萎缩 ,甚至雌性化 ,睾丸横截面积比对照组显著减少 ,细精管管壁也变薄 (P<0 .0 5 )。PCB的上述雌激素样作用能被克罗米酚 (clom iphen)阻断。此外 ,与 E2 相比 ,PCB对雌性和雄性生殖细胞表现出强烈的毒性作用 ,使大多数生殖细胞发生核固缩和胞质空泡化 ,细胞间隙增大 ,雄性的细精管结构也受到破坏。以上结果表明 ,PCB对鸡胚性腺呈现出毒性和雌性激素的双重作用     

五指山近交猪胚胎生殖细胞(EG)嵌合体在我国移植产仔

采集25~28日龄的五指山小型猪(WZSP)胚胎原始生殖嵴细胞(PGCs),用于 WZSP生殖细胞(EG)建系培养技术研究。研究发现:以DMEM含15%胎牛血清、0 1 mol/L巯基乙醇等为基础培养液,分别添加生长因子20 ng/mL LIF、40 ng/mL hSCF、20 ng/mL hbFGF,以STO为饲养层,进行 EG培养建系,WZSP 3 d 可出现克隆,其克隆具有出现早,生长数量多,增殖快,成熟亦早,传代率高的特点。培养 7~10 d需传代或冷冻保存。EG类细胞冷冻、解冻后尚可复苏,并传至11代。若基础培养液不添加生长因子,培养 6~10 d后亦可出现 EG克隆细胞株,但其克隆具有出现晚、数量少、增殖慢等特点。研究中还发现25~26日龄的WZSP胚胎的原始生殖嵴小、不易观察、PGCs分离较困难; 27 ~ 28 日龄的 WZSP 胚胎的原始生殖嵴体积大、易观察、便于分离并可获得多量的PGCs。同时对PGCs进行了形态学、体外分化、AKP染色鉴定等研究。2002 年 9-12 月,在中国农业科学院畜牧研究所五指山猪保种场先后从22头超排处理的大白猪供体中,于配种后(当天为 0 d)5 5~7 d实施手术法获得252枚可用胚。将123枚胚胎显微注射WZSP的EG细胞,每枚注射5~15个细胞,与未注射的 103 枚混合分别移植给9头受体,平均每头受体移植胚胎25 11±5 11枚、含注射 EG细胞胚胎 13 67±3 57 枚,其中 7 头分别     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

兔原始生殖细胞体外培养的研究

旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D 4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次,利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining,AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast,REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+2 ng·mL^-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）+4 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）+10 ng·mL^-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF））所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色; RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。     

自由基吸收类抗氧化剂对延边黄牛体细胞克隆重构胚发育的影响

为提高延边黄牛体细胞克隆重构胚发育率,研究了在体外培养液中单独添加不同浓度的自由基吸收类抗氧化剂维生素E(VE)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和亚硒酸钠(SS)对克隆重构胚发育率的影响。试验中选择成熟培养20～22h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的重构胚在添加不同种类不同浓度抗氧化剂的体外培养液中进行培养。结果表明,在卵裂率上,VE的100μmol.L-1组显著高于其他3组(84.58%vs 57.64%、70.87%、67.64%);50和200μmol.L-1组之间无差异,但都显著高于0μmol.L-1组(70.87%、67.64%vs 57.64%)。EGCG的7.5和15μmol.L-1组显著高于加0μmol.L-1组(79.47%、81.67%vs 69.47%)且其他2组间差异不显著。SS的添加,5ng.mL-1组与0和10ng.mL-1组有显著差异(80.44%vs 70.27%、67.16%);与2.5ng.mL-1组差异不显著(80.44%vs 73.92%),且其他2组间差异不显著;在囊胚发育率上,VE的100μmol.L-1组要显著高于其他3组(26.36%vs 13.04%、18.08%、17.26%)。EGCG的15μmol.L-1组显著高于0和30μmol.L-1组(24.86%vs 8.99%、12.10%),和7.5μmol.L-1组无差异。SS的5与0组和10ng.mL-1组有显著差异(23.31%vs 10.32%、12.65%);2.5ng.mL-1组与0和10ng.mL-1l组有显著差异(19.97%vs 10.32%、12.65%)且其他2组间差异不显著。体外培养液中分别单独添加浓度为100μmol.L-1、15μmol.L-1和5ng.mL-1的维生素E,EGCG和亚硒酸钠都能够显著提高延边黄体细胞克隆牛重构胚的发育率。     

不同添加成分对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞体外成熟是胚胎工程中的一项基础性研究。试验比较了不同添加成分对绵羊卵母细胞的体外成熟及其后续发育的影响。分析了EGF不同添加量、FSH∶LH的不同配比和不同大小卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞的体外成熟的影响。结果表明,①添加30ng/mLEGF的成熟率显著高于其他试验组（85.0%VS60.0%,71.7%,72.7%,P〈0.05）,并可提高绵羊孤雌激活胚的囊胚发育率;②成熟液中添加FSH1μg/mL,LH5.0IU/mL成熟率最高;③在绵羊卵母细胞成熟液中添加3%绵羊大卵泡液,在成熟率上极显著高于20%小卵泡液的添加组（78.6%VS36.5%,P〈0.01）,显著高于3%小卵泡液的添加组和未添加组（78.6%VS60.0%,67.5%,P〈0.05）。     

维生素对牛腔前卵泡体外培养的影响

用改良的McCoy’s 5a无血清培养液 (含 3mML -谷氨酰胺、0 1%BSA、2 0ng/ml睾酮、2 5 μg/ml转铁蛋白、10 0ng/ml胰岛素和 4ng/ml硒 ) ,在 96孔培养板中 ,每孔 2 5 0 μl培养液的条件下 ,研究了维生素C和维生素E对腔前卵泡体外发育的影响。结果表明 :在培养液中添加 90 μM的维生素C有利于维持腔前卵泡体外生长时结构的完整性 ,显著提高牛腔前卵泡体外培养 10天的存活率 (P <0 0 5 ) ,但并没有发现对腔前卵泡的生长、发育和成腔有促进作用 (P >0 0 5 ) ;在培养液中添加3 0 μM的维生素E对Φ >13 0 μm的腔前卵泡及其卵母细胞有促进发育和促进卵泡腔形成的趋势 (P >0 0 5 ) ;在培养液中联合添加 12 μM维生素E和 96μM维生素C ,能显著提高牛腔前卵泡体外培养 10天的存活率 (P <0 0 5 ) ,并对牛腔前卵泡的生长和发育有一定的促进作用 ,但差异不显著 (P >0 0 5 )。