编码杜果丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用Blast X比对发现,有6个阳性克隆是抗病基因同源序列,并命名为PK1～PK6,GenBank注册序列号为AY693369-AY693371和AY776277-AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ～Ⅸ,而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现,6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之,6个克隆不仅是抗病基因同源序列而且是可能的受体样蛋白激酶基因同源序列。     

辣椒NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

辣椒RGA的分离将为进一步从辣椒中分离功能性抗病基因和抗病机理分析打下基础,为辣椒相关抗病基因的克隆提供依据。根据已知抗病基因保守氨基酸结构域设计简并引物,以高抗辣椒品种88为试材,通过PCR扩增抗病基因同源序列。结果表明:从辣椒基因组DNA中分离出1条辣椒抗病基因同源序列WD1。对其编码的氨基酸序列进行分析表明:该序列同时含有P-环(GGVGKTT)、kinase-2(VLDD)、kinase-3(GSRII)及HD(即GLPLAL)保守域结构,分离的辣椒抗病基因同源序列(RGA)与已报道的辣椒抗病基因同源序列A5和A13都有99%的同源性。     

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

 【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列（resistance gene analogs,RGAs）,聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2 基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。     

辣椒LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】克隆和分析抗、感疫病辣椒材料的抗病基因同源序列,为辣椒抗疫病相关基因的克隆奠定基础。【方法】根据番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9 C端的LRR类保守结构域设计简并引物,对6个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA进行抗病基因同源序列的PCR扩增。【结果】得到27个抗病基因同源序列(RGAs),其在GenBank中的登录号为EF064260~EF064286。其中,21个RGAs与番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9有较高的相似性。感病材料的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs。【结论】上述21个RGAs可能与辣椒抗疫病作用有关,可为辣椒抗疫病相关基因的克隆提供依据。     

小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL的RGAP分析

根据抗病基因保守序列合成7对RGAP引物扩增携带Pm 21基因的小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL和感病品种Chancellor,结果只有R11R/R11F引物对在6VS/6AL中扩增出1 317 bp的多态性片段。在其他抗白粉病基因载体品系中检测不到该片段。回收、克隆、测序结果的Blast分析表明,该片段第1-199核苷酸、第520-792核苷酸2个区域与GenBank中的已知序列有较高的类似性,这些序列中均含有抗性蛋白的保守区域。与小麦抗叶锈病基因Lr10的序列(AY270159.1)比较结果显示,两区域的类似性达89%和86%。发现由该片段推定的氨基酸序列包含抗病基因的类似序列,有1个不完整的核苷酸结合位点(NB-ARC)。     

辣椒NBS-LRR类型抗病基因同源序列的克隆及分析

为研究辣椒NBS-LRR类抗病基因的结构和功能特点,运用前人根据NBS-LRR类抗病基因保守结构域(P-Loop和GLPL)设计的简并引物,以辣椒PBC631B的基因组DNA为模板进行PCR扩增,共获得17个具有完整开放阅读框的辣椒抗病基因同源序列(CaRGA01～CaRGA17)。多重序列比对显示这些序列都含有NBS-LRR类基因的6个保守结构域(P-loop、RNBS-A-nonTIR或RNBS-A-TIR、Kinase-2、RNBS-B、RNBS-C和GLPL)。与已知6个抗病基因(Gpa2、L6、M、N、Prf和RPM1)构建系统进化树,发现这17个序列被分为TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR2组,进一步划分为4个亚组(CaRGAⅠ～CaRGAⅣ)。其中,CaRGA01和CaRGA13分别与来自番茄Solanum lycop-ersicum抗细菌性斑点病基因Bs4和番茄Solanum sp.VFNT抗线虫基因Mi-1.4相似性最高,分别为90%和91%,推测这2个序列可能是相关抗病基因的一部分或与相关抗病基因属于同一家族。这些结果将为研究辣椒抗病相关基因提供理论依据。     

编码杧果丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白抗病基因同源序列的克隆与分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增‘紫花芒’杧果嫩绿色叶片基因组DNA。在NCBI中用BlastX比对发现,有6个阳性克隆是抗病基因同源序列,并命名为PK1~PK6,GenBank注册序列号为AY693369~AY693371和AY776277~AY776279。在PK3、PK4和PK6中发现了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的9个催化结构域Ⅰ~Ⅸ,而其它3个克隆具有部分结构域。氨基酸序列同源性分析还发现,6个克隆编码的氨基酸序列都与受体样蛋白激酶有较高的氨基酸序列同源性。系统进化树分析还表明它们都是可能的抗病基因同源序列。总之,6个克隆不仅是抗病基因同源序列而且是可能的受体样蛋白激酶基因同源序列。     

簇毛麦端体6VS的抗病同源序列的克隆及分析

 本研究采用玻璃针切割法对小麦遗传背景下的簇毛麦端体6VS进行了微切割,根据已克隆抗病基因的保守域设计引物,从6VS端体DNA中扩增出10类抗病基因同源片段Hvrgak1-Hvrgak10(GenBank登录号为AF387113-AF387120,AY040671,AY040672)。并利用抗病同源序列作探针,进行与小麦抗白粉病基因的相关分析,结果表明,Hvrgak2、Hvrgak4和Hvrgak5可能与抗白粉病基因相关。这些抗病基因同源片段可以为抗病基因克隆提供切入点或是直接的探针。     

辣椒抗黄瓜花叶病毒同源序列的克隆与分析

根据已知抗病基因的核苷酸结合位点(NBS)保守结构域设计简并引物,以高抗黄瓜花叶病毒的辣椒Yv2007001为试材,获得10条抗病基因同源序列(RGA).经序列分析,这些RGAs皆具有开放阅读框和NBS保守结构域(P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、RNBS-C和GLPL),属于nonTIR-NBS-LRR类抗病基因同源序列.其中RGA46与番茄花叶病毒抗性基因Tm-22的氨基酸同源性为78%,可能与辣椒抗黄瓜花叶病毒(CMV)相关.其它序列与已知抗病基因Prf、RPP13、I2C-1、Mi-1.2、L6、M氨基酸相似性为21%～70%.所得RGA序列的Ka/Ks值为0.011 0～0.305 1,均显著小于1,表明"纯化选择"在辣椒NBS区域进化中起主要作用.     

辣椒炭疽病菌效应因子NIS1-PCR-RFLP标记系统的建立

【目的】基于辣椒炭疽病菌种群复杂、田间复合侵染种群组成不清,导致防控相对困难的问题,建立一种快速直观的辣椒炭疽病菌区分标记系统,为其病害田间防控提供科学依据。【方法】利用rDNA-ITS通用引物克隆田间分离的22株辣椒炭疽病菌rDNA-ITS,通过其序列比对分析构建系统发育进化树,初步确定22株供试菌株的种类和分类地位;选用效应因子NIS1基因为靶标,根据辣椒胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和黄瓜炭疽菌（C.orbiculare）NIS1基因比对分析,设计NIS1基因简并引物,克隆22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因,利用其序列比对分析构建系统发育进化树,分析比较rDNA-ITS和NIS1基因区分供试菌株的差异,进而对22株不同辣椒炭疽病菌NIS1基因进行分析,选择限制性内切酶,分析NIS1基因的PCR产物限制性片段多态性（RFLP）差异,建立NIS1-PCR-RFLP标记系统。【结果】rDNA-ITS序列系统进化分析表明22株辣椒炭疽病菌属于5种炭疽病菌,即胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、短孢炭疽菌（C.brevisporum）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、平头炭疽菌（C.truncatum）和黑点炭疽菌（C.capsici）,其序列同源性为85.6%~99.8%,但C.capsici和C.truncatum处于同一混合组群;22株辣椒炭疽病菌的NIS1基因两端序列较保守,中间存在可变区,与已报道的C.orbiculare的NIS1基因同源性在34.6%~78.9%;NIS1基因系统发育进化树能将22株辣椒炭疽病菌分成5个组群,C.capsici和C.truncatum处于不同组群,表明其区分度优于rDNA-ITS;NIS1-PCRRFLP主要差异片段显示C.gloeosporioides和C.brevisporum的最大片段均为210 bp,但片段数目不同,而C.acutatum为292 bp,C.capsici为685 bp,C.truncatum为345 bp,参照菌株C.orbiculare为497 bp,能够直观观察区分。【结论】研究建立的NIS1-PCR-RFLP标记系统可简便、直观地区分不同辣椒炭疽病菌的差异,有望发展成为真菌新的分子标记应用于田间辣椒炭疽病菌种群的快速鉴定。     

猪园环病毒2型江西株的全基因序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)的全基因组序列,设计1对特异性引物,进行PCR扩增,将1个扩增产物连接到pUCm-T vector上并克隆到大肠杆菌DH5α中,得到1个阳性克隆,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定,证明扩增出了PCV-2目的片段.结果表明本实验分离株(JXPCV-2)与国内外不同地域的PCV-2全基因组序列的差异很小,同源性在94.2%～99.7%;进化树分析表明JXPCV-2与其他10株PCV-2分离株的亲缘关系较近,与浙江分离株(AY691169)亲缘关系最近.     

烟青虫气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

 根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I（GOBP1）和性信息素结合蛋白（PBP）基因的cDNA序列，设计了2对引物，以烟青虫Helicoverpa assulta触角cDNA为模板，分别进行PCR扩增，获得2条特异性条带，约400 bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上，获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明，Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp，编码147个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为17.2 kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405 bp，编码135个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为15.1 kD和5.2。Hass-GOBP1和Hass-PBP具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基，呈酸性。这2个基因已在GenBank中登记，序列号分别是AY864774和AY864775。     

荣昌猪TYP基因克隆及其序列分析

实验根据人、牛的酪氨酸酶(TYR，tyrosinase)基因序列设计了3对引物，扩增出猪的酪氨酸酶基因外显子2，3，4序列，其长度分别为210，135，182bp。对其进行了克隆测序，序列被GenBank收录，登录号分别为：AY236997，AY279998，AY242973。与人、牛、鼠的酪氨酸酶基因序列比对结果显示，TYR基因该区段在人、牛、鼠、猪上极其保守。     

鸭瘟病毒强弱毒株TK基因的克隆及序列比较分析

根据GenBank中已发表的鸭瘟病毒TK基因序列,设计一对引物,对1株鸭瘟病毒强毒和1株鸭瘟病毒疫苗毒进行PCR扩增。将扩增的目的片段分别克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,获得阳性重组质粒,然后对阳性重组质粒进行序列测定及分析。结果表明,本实验所扩增的鸭瘟病毒TK基因及侧翼UL24基因大小为1 995 bp,鸭瘟强、弱毒株TK基因及侧翼UL24基因序列完全相同,该病毒TK基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911509与AY963569,四川株DQ640611,AV1221株EF173464,sd-01株EF417996同源性分别为99.5%,99.9%,100%,99.9%,100%,而该病毒UL24基因与鸭瘟病毒其它毒株AY911511,DQ227739,EF417996同源性为99.9%,99.8%,99.9%,表明鸭瘟病毒强弱毒株TK基因及侧翼UL24基因高度保守。为构建鸭瘟病毒TK基因缺失的转移载体奠定了基础。     

广西鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的东北白鹅α干扰素（IFN-α）基因（AY524422）序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从经鹅副粘病毒（GPMV）刺激培养的鹅外周血淋巴细胞中克隆获得广西鹅IFN-α基因,将其连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞后进行序列分析.结果表明,广西鹅IFN-α基因完整的开放阅读框大小为576 bp,共编码192个氨基酸残基,其推导的氨基酸中有7个半胱氨酸残基和2个潜在的糖基化结合位点（NDT和NHT）.与GenBank上已公布的其他IFN-α基因进行同源性比较分析,发现广西鹅IFN-α基因与东北白鹅的同源性最高（核苷酸同源性为98.3%、氨基酸同源性为96.4%）,与鸡、牛、猪、鼠、犬、人等的同源性较低.说明IFN具有种属特异性,且亲缘关系越近同源性越高,这与物种之间的进化亲缘关系一致.     

猪圆环病毒2型广东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组序列,设计2对特异性引物,对广东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征(PMW S)组织病料进行了PCV2全基因组克隆和序列分析.结果表明,PCV2核苷酸序列较稳定,不同地区6个PCV2毒株全基因组序列均由1 767 bp组成,彼此间核苷酸序列相似性达95.3%~99.8%,亲缘关系密切;与GenBank已发表的国内不同地区PCV2参考毒株的相似性介于70.1%~99.1%;与欧洲各地区毒株的相似性介于67.7%~98.8%;其中与美国的毒株(AY094619)差异性最大,介于69.4%~70.8%之间.     

cGHR基因第8及第9内含子的克隆和分析

通过克隆测序,获得cGHR基因内含子8及9的全部序列,内含子8长l397bp,内含子9长272bp．为验证该两序列为新发现的未知序列,将该两条序列在NCBI网站上进行Blast分析,结果表明,该两段序列均为新发现的未知序列,GenBank登录号分别为AY481574和AY327492．cGHR基因内含子序列的获得,有利于进一步研究cGHR基因的表达调控和全基因的SNPs筛选。     

马铃薯纺锤块茎类病毒山西分离物侵染性克隆的构建

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。     

北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析

根据报道的10几种真菌漆酶氨基酸序列的保守区域设计了一对简并引物,以北方梭囊孔菌总DNA为模板,通过PCR扩增到一个1 201 bp的基因片段.将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示99个序列,全部为漆酶基因及其类似基因,因而认为克隆到的片段就是北方梭囊孔菌漆酶基因片段.经过与同源性最高的粗毛革孔菌（laccase lcc1）同一区段编码区序列进行ClustalW比较,其中有6个间隔区,确定为内含子区.去除内含子后,推导的氨基酸序列为286个残基.经与其他几种真菌漆酶的氨基酸序列进行ClustalW比对,同源性均在51%以上.