梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的克隆及生物信息学分析

以黄金梨（Pyrus pyrifolia Nakai）茎尖为试材,应用同源克隆和RACE方法从梨茎尖中克隆到赤霉素合成代谢的关键酶：内根-贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA的全长序列,命名为PpKO,GenBank登录号为：HM003112,其长度为1 752 bp。PpKO的开放阅读框（ORF）编码515个氨基酸,相对分子量为59.007 kD,等电点为7.19。氨基酸同源性分析表明,PpKO与已报道的其它植物的KO氨基酸序列具有59.4% ~ 95.9%相似性;氨基酸聚类分析表明,梨和苹果首先聚类,其次是草莓;生物信息学分析表明：PpKO含有细胞色素P450核心功能域FXXGXRXCXG和氨基端的跨膜结构域。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

应用抑制性消减杂交技术从枳中筛选根特异表达基因

为筛选分离植物根组织特异表达基因,以枳根RNA为试验组,叶RNA为驱动组,构建了枳根消减文库。从该消减文库中共获得有效序列1 177个,其片段长度主要分布在200 ~ 500 bp;序列拼接后得到455个非重复序列,其中245个与已知基因匹配,具有结合功能、催化活性和转运活性等生物学功能,可参与植物的代谢、细胞生长、个体发育、应激反应等生物学过程。实时定量PCR检测结果显示这些基因中的主要乳液蛋白、早期结瘤素样蛋白和贝壳杉烯酸氧化酶等基因在根中高表达。     

森林草莓‘Ruegen’果胶裂解酶基因的克隆及荧光定量表达分析

根据森林草莓(Fragaria vesca)果胶裂解酶(Pectate lyase)基因序列信息设计引物,克隆了森林草莓‘Ruegen’的果胶裂解酶基因PLA、PLB和PLC。利用MEGA5.0软件将这3个基因编码的氨基酸序列与其他植物的果胶裂解酶氨基酸序列进行聚类分析,同时采用荧光定量PCR的方法对‘Ruegen’植株不同器官及不同发育时期果实的果胶裂解酶基因表达量进行分析。结果表明:PLA、PLB和PLC在其植株各器官中均有表达,且在发育后期果实中的表达量明显高于其他器官,结合进化树以及果实发育过程中果胶裂解酶活性变化,推测果胶裂解酶基因对草莓果实发育后期的软化具有调节作用。     

梨矮化砧木‘中矮1号’生长素氢转运体基因PcAHS及其启动子的克隆与表达分析

以梨（Pyrus communis L.）紧凑型矮化砧木‘中矮1号’及其母本‘锦香’新梢韧皮部为试材,根据转录组测序结果设计特异性引物,克隆到1个长1 239 bp的基因序列。该序列在两个品种间不存在差异,均编码412个氨基酸,其氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、梅（xp_008242099.1）、毛果杨（xp_002306421.2）、草莓（xp_00428771.1）的生长素氢转运体基因（AHS）编码的氨基酸序列的相似性在67% ~ 99%之间,命名为PcAHS。qRT-PCR分析发现,‘中矮1号’新梢韧皮部中PcAHS的表达量均低于母本‘锦香’,推测其启动子序列存在差异。‘中矮1号’及其母本‘锦香’PcAHS 基因上游启动子长度分别为828 bp和888 bp,二者相似性89.1%。序列分析发现‘中矮1号’PcAHS基因启动子有一段58 bp（–496 bp ~–553 bp）的缺失;利用植物顺式作用元件数据库PLACE和PLANTCARE分析表明,‘中矮1号’启动子含有一个‘锦香’没有的BPBF转录因子结合元件P-box。推测‘中矮1号’PcAHS基因启动子特有的片段缺失和P-box转录因子结合元件可能是导致其表达量低并通过影响生长素的运输最终引起矮化的原因。     

‘达赛莱克特’草莓果实发育成熟过程中香气物质的变化及其特征成分的确定

【目的】明确‘达赛莱克特’草莓果实挥发性物质的组成与含量特征,揭示果实发育成熟过程中香气动态变化规律。【方法】以水培‘达赛莱克特’草莓绿果期、白果期、转色期、粉果期、全红期5个不同发育时期的果实为试验材料,使用顶空固相微萃取(HS-SPEM)和气相色谱-质谱(GC-MS)技术,检测各样品中香气组分。【结果】从‘达赛莱克特’草莓中共检测出70种物质,主要成分为醛类、酮类、酯类和萜烯类。其中绿果期和白果期以醛类为主,转色期出现少量的酯类,粉果期以酯类和醇类为主,全红期酯类和醇类较粉果期多。【结论】基于香气阈值,共鉴别出‘达赛莱克特’草莓特征香气17种,其中己酸乙酯、(E)-2-己烯醛、丁酸乙酯、γ-癸内酯、DMMF、D-柠檬烯、β-金合欢烯等的贡献较大。     

基于梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO 序列的功能性SNP 标记

 基于基因序列的功能性标记是基因分型、图谱定位和相关性状标记辅助选择的理想标记。以‘矮生梨’ב茌梨’的梨杂交分离群体和9个梨栽培品种为试材,以梨赤霉素合成代谢途径的关键酶基因--贝壳杉烯氧化酶基因（PpKO）的cDNA序列为基础,设计5对PCR引物,通过高通量熔解曲线（high resolution melting,HRM）分析,筛选到可对基因进行良好分型的1对引物。通过对杂种后代和测试品种的测序分析表明,此对引物的扩增子是一个位于PpKO第8外显子上的长度为200 bp的序列,从中共检测到两处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）变化,且均为非同义cSNP。这两处SNP标记均可以作为适合高通量分析的遗传标记在遗传作图、基因定位或资源鉴定中加以利用。     

黄瓜贝壳杉烯氧化酶基因CKO 的克隆及其表达分析

 以‘戴多星’黄瓜为试材,应用同源克隆和RACE技术从茎尖中得到赤霉素合成的关键酶--贝壳杉烯氧化酶（KO）基因cDNA全长序列,命名为CKO,GenBank登录号为JN792591,其长度为1 895 bp,开放阅读框（ORF）编码519个氨基酸,相对分子量为59.211 kD,等电点（PI）8.45。氨基酸同源性分析发现,CKO与苦瓜的KO同源性最高,达84%;序列结构分析表明,CKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域。实时荧光定量分析表明,CKO在遮荫的徒长苗中表达量最高,是正常苗的5.18倍,在遮阴条件下喷施多效唑可降低期表达。     

西瓜交替氧化酶AOX2基因的克隆与分析

为了研究西瓜交替氧化酶基因家族在西瓜植株中可能发挥的功能,以西瓜（Citrullus lanatus）耐冷种质IVSM9为材料,根据植物不同物种交替氧化酶基因核苷酸保守区序列设计兼并引物,得到西瓜交替氧化酶（alterna-tive oxidase）AOX基因的中间片段。在已知序列的基础上,分别设计5’和3’末端扩增的...     

草莓新茎分枝与独脚金内酯的关系

【目的】探究独脚金内酯对草莓新茎分枝的调控机制。【方法】利用超快速液相-电喷雾离子化-串联质谱方法(UFLC-ESI-MS/MS),测定不同新茎分枝数的‘红颜’(Fragaria ananassa‘Benihoppe’)和‘C5’植株根和新茎在不同分枝发育过程中独脚金内酯含量,并采用半定量PCR对7个独脚金内酯合成和信号转导基因(FaD27、FaCCD7、FaCCD8、FaP450、FaD14、FaD53和FaD3)进行表达分析。【结果】草莓植株中检测到5-脱氧独脚金醇、独脚金醇和列当醇3类天然独脚金内酯成分,它们在‘红颜’和‘C5’不同组织中的变化趋势不同‘。红颜’和‘C5’中独脚金内酯含量随着分枝发育时期呈规律性变化,新茎中均表现为先减少后增加的趋势,而根中变化趋势与之相反,随着分枝发育‘红颜’中独脚金内酯含量逐渐增加,而‘C5’独脚金内酯含量逐渐降低。半定量PCR结果显示FaD27基因在‘红颜’的根和新茎中表达量差异明显,并且该基因的表达量与独脚金内酯含量的变化趋势相同。【结论】推测‘红颜’分枝较少以及‘C5’分枝较多与草莓根中合成独脚金内酯含量增加和减少直接相关,新茎中分枝前期独脚金内酯含量降低能够增加草莓新茎分枝,但随着分枝增加新茎中会积累较多的独脚金内酯从而抑制分枝的进一步增加。研究为独脚金内酯在草莓中调控新茎分枝的作用机制提供一定的参考。     

苹果内根-贝壳杉烯氧化酶基因的克隆及序列分析

内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)是赤霉素合成代谢的关键酶。以苹果(Malus×domestica Borkh.)品种富士(Fuji)为供试材料,应用同源克隆和RACE方法从其茎尖中克隆到KO的cDNA全长序列,命名为MdKO,GenBank登录号:AY563549,其长度为1 859 bp。MdKO的开放性阅读框(ORF)编码514个氨基酸残基,推断其相对分子量为58.9 ku,等电点为7.63。氨基酸同源性分析表明,MdKO与已报道的其他植物的KO氨基酸序列具有较高的相似性;氨基酸聚类分析表明,苹果和梨首先聚类,其次是葡萄;序列结构分析表明MdKO属于细胞色素超家族P450系,具有细胞色素P450的血红素结构域FXXGXRXCXG和跨膜结构域;亚细胞定位分析发现MdKO可能位于内质网膜上。     

草莓连作土壤灭菌与施用有机肥对根际土壤酚酸及土壤酶活性的影响

针对草莓连作土壤灭菌后与正茬相比草莓植株根系生长受到抑制,研究了连作土壤灭菌与施用不同种类肥料对草莓幼苗（移栽60 d后）根系分泌酚酸及土壤相关酶活性的影响。结果表明：连作土壤灭菌与施用有机肥料处理显著提高了草莓植株根际土壤中酚酸的含量,其中施用蚯蚓粪（经蚯蚓食用处理的牛粪）的增幅显著低于施用牛粪。土壤灭菌处理后施加不同肥料,土壤多酚氧化酶活性均能较快恢复;有机肥较无机肥能显著促进过氧化氢酶活性的恢复;蚯蚓粪较牛粪和无机肥能显著促进土壤脲酶活性的提高;土壤蔗糖酶受土壤灭菌影响显著降低且施加不同肥料对其没有显著地影响。综上所述,对于草莓连作土壤,无论灭菌与否,施用蚯蚓粪较牛粪能减轻连作障碍中的酚酸化感效应,促进脲酶等土壤相关酶活性提高,是缓解连作障碍及连作土壤灭菌对草莓植株生长发育影响的有效措施。     

四种寄主来源的灰葡萄孢对草莓的致病力分化研究初报

 从合肥、蚌埠、长丰、和县等地采集的番茄、辣椒、草莓、葡萄等发病组织上分离鉴定获得23个灰葡萄孢菌株, 采用菌丝块创伤接种法, 分别测定了这些菌株对草莓果实和叶片的致力。结果初步表明, 所有供试菌株接种草莓果实和叶片后均引起发病, 但病斑的平均直径有显著差异, 并在不同草莓品种上表现也有差异, 显示灰葡萄孢菌株间对草莓果实和叶片的致病力存在明显的分化。按照在草莓果实和叶片所致病斑的平均直径大小可将供试菌株划分为致病力较强、中等和较弱3种类型。总体来说, 来自草莓和番茄的菌株对草莓果实和叶片的致病力较强, 来自辣椒的菌株对草莓果实和叶片的致病力较弱, 但来自相同寄主的菌株间致病力也存在差异, 菌株致病力差异与菌株地域来源无明显相关。     

多层覆盖与草莓早熟性及产量关系的研究

本试验通过大叶鸡冠和宝交早生两品种二层覆盖(大棚+地膜)和三层覆盖(大棚+小棚+地膜)的栽培试验,初步探明早熟丰产的保护地栽培形式。结果表明:(1)三层覆盖与二层覆盖成熟期基本相同,三层覆盖前期产量高于二层覆盖,但总产量是二层覆盖高于三层覆盖。二层覆盖具有省工省料,操作方便之优点。试验认为二层覆盖为草莓保护地生产的最佳覆盖形式。(2)宝交早生前期产量、总产量显著大于大叶鸡冠,是适宜于保护地栽培的比较好的品种。(3)宝交早生二层覆盖栽培是获得早熟高产的理想形式。     

Methyl jasmonate plays a role in fruit ripening of ‘Pajaro’ strawberry through stimulation of ethylene biosynthesis

The role of methyl jasmonate (MJ) in strawberry (Fragaria × ananassa Duch. cv Pajaro) fruit ripening was investigated by monitoring its endogenous concentrations in fruit at various stages of development and the effects of exogenously applied MJ at these stages on ethylene biosynthesis. The concentration of endogenous trans-MJ was significantly higher in the white fruit (31.7–162.2 ng g⁻¹) and decreased sharply in half and fully ripe fruit. Higher concentrations of endogenous trans-MJ at the white stage of strawberry fruit development followed by a decline during fruit ripening indicate that MJ may play an important role in modulating fruit ripening. Significantly increased ethylene production was measured in the fruit when MJ was applied at white, half ripe and at fully ripe stage. The application of MJ (50 μM) resulted in significantly highest ethylene production and increased activities of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) synthase and ACC oxidase as compared to all other treatments. The effect of exogenously applied MJ on ethylene production, ACC synthase and ACC oxidase activities was dependent on concentration of MJ applied and on fruit developmental stage. In conclusion, MJ in strawberry modulates fruit ripening, as its concentration is higher in white fruit and is declined with the progression of ripening and exogenous application of MJ increases ethylene production, activities of ACC oxidase and ACC synthase depending upon the concentration of MJ applied and fruit developmental stage.     

草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

草莓果实中脱落酸受体基因FaABAR/CHLH表达变化及其影响因素分析

 为了探讨脱落酸调控草莓果实成熟的信号识别机制,以‘北农香’草莓花后1 ~ 4周的果实为试材,在克隆脱落酸受体基因FaABAR/CHLH的基础上,通过荧光定量PCR研究了果实发育过程中该基因表达量的变化及其影响因素。结果表明,草莓果实中脱落酸受体FaABAR/CHLH基因编码一个含有1 381个氨基酸的蛋白,且该蛋白含有一个金属离子螯合酶H亚基超家族保守区。在果实发育的前期（小绿、大绿和浅绿果期）,FaABAR/CHLH基因表达量维持较高水平;随着果实的加速褪绿,其表达量迅速降低,至白果期降到最低点;随着果实着色启动,其表达量又迅速上升。ABA和高pH能促进FaABAR/CHLH基因在转录水平上的表达,而蔗糖则抑制该基因转录水平。草莓果实中脱落酸受体基因FaABAR/CHLH表达水平的变化进一步揭示了ABA在调控果实成熟中的重要作用。     

森林草莓独脚金内酯合成关键基因D27的克隆与表达分析

根据森林草莓中独角金内酯合成过程中的关键基因D27的序列信息设计引物,获得了D27基因的完整开放阅读框架。采用MEGA5.0软件,对森林草莓与其他物种D27基因编码的氨基酸序列进行聚类分析,发现森林草莓D27基因与其他物种D27基因具有较高的同源性。设置正常供磷、缺磷和在缺磷条件下接种丛枝状菌根真菌处理,利用电感耦合等离子发射光谱仪测定草莓植株的磷含量,结果表明缺磷条件下接种丛枝状菌根真菌,草莓植株中磷含量极显著提高,而缺磷处理的磷含量极显著降低。实时荧光定量PCR结果表明,与正常供磷处理相比,缺磷和接种丛枝状菌根真菌处理条件下,D27基因的表达量分别上调7倍和11倍,这说明D27基因的表达既受到磷水平调控,又受到菌根形成的调控。