RNA干扰技术及其在马立克病端粒酶研究中的应用

RNA干扰是一种在动植物中广泛存在的、由双链RNA诱发的、同源mRNA特异性沉默的过程,具有高特异性、高效性和可遗传性等特征。RNA干扰技术已成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一。端粒和端粒酶系统可以调节细胞的增殖,通过抑制端粒酶的活性而抑制细胞的增殖是肿瘤治疗的新策略。文章综述了RNA干扰技术对端粒酶活性调节方面的研究进展及其在鸡马立克病防治方面的应用前景。     

chTERT基因小干扰RNA对马立克氏病MDCC-MSB1细胞端粒酶活性的影响

本研究利用小干扰RNA技术探讨端粒酶催化亚单位对鸡马立克氏病MDCC-MSB1细胞端粒酶活性的影响。构建以chTERT基因为靶点的3个RNA干扰载体pRNAT-chTERT-siRNA,筛选并鉴定。利用脂质体转染MDCC-MSB1细胞48 h后,TRAP-PCR-ELISA法定量检测细胞端粒酶活性,并进一步筛选出最有效的小干扰RNA载体。结果显示:转染干扰载体的MDCC-MSB1细胞端粒酶活性逐渐降低,其中干扰载体pRNAT-chTERT-II转染后抑制效果最明显(0.01)。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

RNA干扰技术及其在猪繁殖与呼吸综合征治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)技术是近年来发现的由双链小RNA(siRNA)介导的以序列特异性方式诱导同源mRNA 降解的新技术.由于其特异性和有效性,已被认为是一种重要的特异性基因阻断技术.将RNA干扰技术应用于猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)治疗中能明显抑制病毒复制,为猪繁殖与呼吸综合征的预防和治疗开辟了一条新途径.文章就RNA干扰(RNA0技术和其在猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)治疗上的应用进行了综述.     

RNA干扰技术抑制口蹄疫病毒复制研究进展

RNA干扰(RNAi)技术作为一种特异性地抑制哺乳类细胞外源性或内源性基因表达的方法,近年来在口蹄疫病毒(FMDV)防治研究中迅速发展起来。文章综述了利用RNAi技术抑制口蹄疫病毒复制的各种策略,包括化学合成或病毒载体转染构建抑制FMDV复制的小干扰RNA(siRNA)、构建多个FMDV功能区的SiRNA、交叉抑制不同血清型FMDV的siRNA的设计和双功能载体来双向防控FMDV的SiR-NA设计。RNAi干扰技术的发展,为设计防治口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

细胞亲环蛋白A对猪瘟病毒增殖的影响

细胞亲环蛋白A(CyPA)在多种病毒感染中起重要的调控作用。本实验室前期蛋白质组学研究表明,猪瘟病毒(CSFV)感染PK-15后细胞的CyPA明显上调表达。为研究CyPA在CSFV增殖中的作用,本研究首先采用环孢素A(CsA)处理PK-15细胞,特异性地抑制CyPA顺反异构酶活性,观察对CSFV的影响,在CsA处理后24 h、48 h、72 h收集细胞和细胞冻融上清,进行病毒基因组拷贝数和病毒滴度测定。结果表明CsA处理能够抑制CSFV在PK-15细胞中的增殖。同时,采用RNA干扰方法,下调PK-15细胞中CyPA的表达,结果也能够抑制CSFV在细胞中的增殖。本研究结果证明CyPA对CSFV在PK-15细胞中的增殖具有调控作用,对进一步阐明CSFV与宿主细胞蛋白的相互作用具有重要意义。     

枯草芽孢杆菌对轮状病毒感染IPEC-J2细胞相关TLRs mRNA表达的影响

为研究枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是否通过激活猪肠上皮细胞(IPEC-J2)中Toll样受体(TLRs)的表达抑制轮状病毒(RV)的复制,本研究采用RV感染灭活B.subtilis预处理的IPEC-J2细胞,鉴定B.subtilis对RV在细胞中增殖的抑制作用,并检测不同时间点RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞中相关TLRs的表达。结果显示,RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞24 h后,与未处理细胞相比,其病毒的增殖能力显著被抑制。通过荧光定量PCR检测不同处理组细胞TLRs m RNA的表达水平,结果表明RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞在感染早期(1 h和3 h)与其他组相比,TLR2、TLR3、TLR9 m RNA表达均显著增加。本研究表明,灭活的B.subtilis能够抑制RV在IPEC-J2细胞中的增殖,并在病毒感染初期显著提高细胞TLRs m RNA表达,推测可能与调节宿主细胞的先天免疫反应有关。     

RNAi靶向NP、L基因抑制鹅源副黏病毒在鸡胚成纤维细胞中的复制

构建了针对鹅源副黏病毒(GPMV)NA-1株NP及L基因的RNA干扰质粒;将转染质粒36 h后的鸡胚成纤维细胞接种病毒,通过病毒滴度、实时荧光定量RT-PCR、细胞病变以及间接免疫荧光结果分析,表明均能抑制GPMV在CEF中复制和增殖.本试验对研究GPMV复制和抗病毒治疗提供了技术基础.     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是1998年在对秀丽线虫的研究中发现的.RNAi利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解相应序列的mRNA.从而特异性地阻断相应基因的表达.本文介绍了RNA干扰现象的发现、分子机制、生物学意义及其技术的应用发展.     

RNAi技术抑制禽主要病毒感染的研究进展

RNA干扰(RNAi)是由内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象.1998年,Fire首次发现dsRNA并将其注入线虫(C.elegans)体内可特异性抑制基因表达,将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象称为RNAi.     

miRNA在哺乳动物配子发生中的作用研究进展

哺乳动物配子发生的基因表达调控包括编码基因的阶段特异性表达调控及非编码基因的转录和转录后水平调控。微小RNA(microRNA, miRNA)作为一类小的非编码RNA, 通过识别靶基因非翻译区的结合位点, 导致mRNA降解或者蛋白质翻译抑制, 从而在转录后水平发挥调控作用。近年来, miRNA在哺乳动物生殖活动中的作用逐渐被揭示, 越来越多的研究表明, miRNA在哺乳动物精子发生、精子成熟、卵母细胞成熟、卵泡发育及早期胚胎发育等过程中都发挥着重要的调节作用, 其可通过调节支持细胞的增殖和凋亡或精原细胞、精母细胞及精细胞的细胞周期进程, 在精子发生的不同阶段发挥间接或直接调控作用, 也可通过调节卵母细胞、卵丘细胞以及颗粒细胞的增殖、凋亡、激素合成和细胞间作用, 对卵母细胞的发育和成熟过程进行调控。作者主要介绍了在哺乳动物配子发生过程中, miRNA的细胞和阶段特异性表达及其对靶基因的调节作用, 以期为深入研究哺乳动物配子发生的调控机制提供参考。     

干扰lncbMD对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在研究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究以体外分离培养的鲁西黄牛胎牛原代骨骼肌卫星细胞为试验材料,体外诱导成肌分化,以前期高通量测序筛选的肌肉组织特异性表达lncRNA为靶标,通过RACE技术对其进行全长扩增,命名为lncbMD,对lncbMD进行生物信息学分析和亚细胞定位。收取增殖期和分化期第1、2、3天的细胞,提取RNA(每组设置4个重复)或蛋白质(每组设置3个重复),通过qRT-PCR检测lncbMD在牛骨骼肌卫星细胞分化进程中不同时期的表达情况。根据lncbMD的序列设计合成干扰RNA,转染牛骨骼肌卫星细胞干扰lncbMD的表达,利用EdU试验检测细胞增殖情况,qRT-PCR技术检测lncbMD干扰效果、lncbMD的mRNA表达水平,增殖标志因子Pax7、Cyclin D1以及分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平,荧光倒置显微镜观察细胞生长情况。结果显示,lncbMD全长序列1 902 nt,位于牛基因组23号染色体上,不具有编码潜能,是一条未报道的lncRNA。在牛骨骼肌卫星细胞与肌管中均主要存在于细胞核,在牛骨骼肌卫星...     

家蚕核型多角体病毒增殖关键基因的鉴定

选择家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)基因组中可能与病毒增殖相关的8个基因dbp、lef-2、lef-3、lef-7、lef-10、lef-11、p143和vp1054作为候选基因,利用家蚕内源性microRNA骨架构建候选基因的干扰载体,并采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对上述候选基因进行干扰试验,筛选病毒增殖的关键基因,以期为开辟家蚕抗Bm NPV研究新路径打下基础。对8个候选基因的RNA干扰试验显示:干扰lef-7对Bm NPV的增殖没有明显影响;对lef-2和lef-11表达的干扰效率最高,达到90%以上,其中干扰lef-11后病毒对细胞的感染率仅为9.16%,远远低于对其他基因干扰后的感染率。依据试验结果初步确认8个病毒增殖相关基因中,lef-11对病毒增殖的影响最大。     

RNA干扰在哺乳动物中的应用

从2001年《Nature）杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通过siRNA成功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。2003年Rubinson DA等又在Nature Genetics上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞，干细胞和转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。     

肝脏特异性表达载体的构建及Western blotting检测

研究靶向于肝细胞的组织特异性siRNA,实现siRNA基因治疗的组织特异性,可用于特异性治疗乙肝,突破RNA干扰技术在临床应用的一大障碍。用靶向于EGFP的siRNA（以下简称siEGFP）替代靶向于乙肝病毒保守区的siRNA,构建可以在肝细胞中特异性表达的载体,用来表达siRNA。将目标载体分别转染肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MDB-MB-231、人胚肾细胞293,在蛋白质水平上检验siRNA抑制的组织特异性。Western blotting结果证实,siEGFP在肝组织来源的细胞系HepG2中抑制效率明显高于其他两组细胞。构建的载体可以在肝癌细胞系中特异性的表达siRNA,而在其他组织细胞中不表达,实现了组织特异性。进一步将siEGFP替换为抑制HBV表达的siRNA,同样可以实现肝脏特异性的表达。     

RNA干扰抑制猪瘟病毒增殖的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、调控基因表达的监控机制,是存在于真核细胞内的一种自我保护现象。随着对RNA干扰机制的深入理解,其在病毒性疾病上的应用的研究也初显成效。作者概述了RNA干扰的作用机制及抑制猪瘟病毒增殖的研究现状,并提出了存在的问题和研究方向。     

RNA干扰技术应用研究进展

RNA干扰技术作为一个强有力的反向遗传学工具,不仅为抑制基因表达提供了高效、特异性的手段,而且为基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治疗研究提供了重要的技术方法。本文就近年来RNA干扰技术在动物抗病毒感染研究、动物基因组学研究及转基因动物等方面的应用最新进展作一简述。     

靶向TLR9基因siRNA的筛选及其对BHV-1增殖规律的影响

为研究牛胚胎气管（bovine embryonic tracheal,EBTr）细胞Toll样受体9（Toll-like receptors 9,TLR9）在牛疱疹病毒Ⅰ型（bovine herpesvirus type 1,BHV-1）感染的天然免疫反应中的作用,本试验利用小分子干扰RNA（siRNA）技术,以TLR9为靶向分别设计并合成3条siRNA干扰序列,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测应用siRNA-TLR9干扰后TLR9基因的表达变化,筛选出最佳的siRNA-TLR9干扰序列,继而转染EBTr细胞使其TLR9基因沉默后感染BHV-1,用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测BHV-1不同时间点的增殖变化。结果显示,转染48 h后,与阴性对照组相比,siRNA-TLR9A、siRNA-TLR9B和siRNA-TLR9C分别对TLR9 mRNA表达量下调了60.90%、24.05%和40.75%。筛选出siRNA-TLR9A片段在12~72 h可以显著抑制TLR9 mRNA表达（P < 0.05）。用该片段转染EBTr细胞再感染BHV-1后,6~72 h siRNA-TLR9A组BHV-1 DNA拷贝数低于对照组。本试验成功筛选出了特异性的抑制EBTr细胞TLR9基因的siRNA序列,并证明抑制TLR9的表达可降低BHV-1的增殖能力。