转基因香石竹中间试验的农艺性状评价

为了研究转基因香石竹品系月之霓裳Moonshade、月之伊人Moonlie及其亲本品种FE123在农艺性状方面是否存在差异,提供转基因香石竹的环境安全性评价数据,对植物生长和开花时期的农艺性状数据进行统计学分析.结果表明:这两个转基因香石竹品系与其受体品种在越夏能力、侧枝数目、植株高度、叶片宽度、叶片厚度、花的直径、花冠高度、花柱数目、花萼数目、雄蕊数目等性状上没有显著差异,而植株茎粗、叶片长度和花瓣数目差异极显著.此外,月之伊人Moonlite的花柱长度小于亲本品种,差异显著.     

转基因康乃馨Moonlite品系检测用质粒标准样品研制

截至2020年底,国际上已有19种转基因康乃馨品系进入商业化种植。为了实现转基因康乃馨的有效检测监管,研制检测标准样品十分必要。目前,国际上还没有该类标准品的相关报道。为此,本文研制了商业化时间最长、种植量较大的转基因康乃馨Moonlite品系质粒标准样品,使其与转基因康乃馨检测技术标准的应用相配套,为口岸转基因产品的检测监管提供必要的技术支撑。首先,将康乃馨内源ANS基因1 279 bp片段和转基因康乃馨Moonlite品系406 bp 5'端特异性序列分别插入到pcDNA3.0载体的酶切位点和距离1 kb以上的多克隆位点上,合成质粒DNA标准样品。后将质粒DNA标准样品进行稀释、分装,对其均匀性、最小取样量和短期、长期稳定性等进行测定,采用数字PCR方法对质粒DNA标准样品进行定值,并进行不确定度评估。质粒DNA标准样品pLite经全基因组测序,与公开发布的序列完全一致。均匀性实验结果表明,分别以ANS基因和Moonlite品系特异性序列为目标进行测定,F值分别为1.61和1.14,均小于95%置信区间的F值,质粒DNA标准样品足够均匀。质粒DNA标准样品的最小取样量为2 μL。稳定性实验结果表明,质粒DNA标准样品pLite在45 ℃高温条件下,可稳定保存14 d;在26 ℃及以下温度条件下,可稳定保存1个月,在4 ℃及以下温度可稳定保存6个月,说明质粒DNA标准样品适宜运输。质粒DNA标准样品在反复冻融25次后,拷贝数浓度无显著变化。定值结果表明,质粒DNA标准样品pLite中康乃馨内源ANS基因拷贝数的参考值为(6.13±0.22)×10⁶ μL^-1,Moonlite品系特异性序列拷贝数的参考值为(6.10±0.24)×10⁶ μL^-1。研制的质粒DNA标准样品pLite具有良好的均匀性和稳定性,获得国家标准样品证书后,可用于转基因康乃馨Moonlite品系的检测。     

转Cry1Ab水稻纯合体快速准确的PCR鉴定方法

转Cry1Ab基因水稻Bt22为一种新型的转基因抗虫水稻,本研究介绍了一种筛选纯合转基因植株Bt22的PCR方法。根据外源序列在Bt22中插入位点的两侧旁邻序列设计引物,建立了转基因抗虫水稻Bt22品系特异的定性PCR检测方法,该方法灵敏度可达0.01 ng,在此基础上组合各引物建立了筛选转基因水稻Bt22纯合体的多重PCR方法,结果表明该方法简单高效,便于操作。     

课题名称：基于生理生态过程的南方果树可视化建模与生长系统开发

课题内容、目标：分离鉴定我国商业化转基因产品的主要靶标分子,包括启动子、终止子、目的基因、外源基因和基因组的旁邻序列,利用生物信息学方法分析设计适合这些靶标序列的通用模板（UT）序列,设计通用荧光探针（UT-探针）、UT—PCR引物,优化引物、探针浓度等,建立以通用UT探针为基础针对我国主要商业化生产的转基因大豆、     

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.     

油菜突变体库构建与激素反应基因克隆分析

以优质高产的油菜品种1244W6为材料,采用浸花蕾方法,将含有激活标记和Basta筛选标记质粒pSKI015的农杆菌进行转化,成功构建了油菜激活标记突变体库.通过Basta筛选,结果共获得约30 000个转基因株系(T1代).将部分转基因株系种子(T2代)培养在不含任何激素、或含有不同浓度植物激素的营养液中,结果筛选出激素反应突变体63个,长下胚轴和短下胚轴突变体分别为15和13个.采用TAIL-PCR技术,克隆了W1016激素反应突变体T-DNA插入位点基因组旁邻序列.     

转基因大豆‘ZH 10-6’数字PCR精准定量检测方法的建立

为实现转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’转化体成分的精准定量检测,以转基因大豆‘ZH 10-6’的5′端边界序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针浓度进行优化,经特异性测试,建立了耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’的微滴式数字PCR检测方法。结果表明:1)特异性良好:只有以转基因耐除草剂大豆品种‘ZH 10-6’基因组为模板才有扩增信号;2)灵敏度高:在相对标准偏差≤25%的情况下,方法的检出限(LOD)为13.0个拷贝;定量限(LOQ)为66.0个拷贝;3)PCR扩增反应模板含量与样品拷贝数之间线性相关系数R²>0.99,DNA含量线性范围为0.08%~100.00%。综上,本研究建立的转基因耐除草剂大豆‘ZH 10-6’转化体定量方法特异性强、稳定性好、准确度和灵敏度高,可用于对转基因大豆品种‘ZH 10-6’的定量检测。     

抗虫和耐除草剂玉米Bt176定性PCR检测的灵敏度研究

研究依据农业部869号公告-8-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法,以玉米内标基因zSSIIb和外源基因Bt176转化体特异性序列为检测的目的片段,对农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（太原）提供转基因成分含量分别为10%、1%、0.1%的转基因玉米粉进行检测,证明此方法的检测灵敏度高,转基因玉米的检出下限可达0.1%。     

辣椒内标准基因及其在食品检测中的应用

本研究首先通过BLAST搜索,对92个辣椒基因进行比对分析,获得了5对辣椒内标基因候选序列,接着利用PRIMER5.0PCR设计引物,对候选基因进行种内非特异性和种间特异性分析,PEP261(编码辣椒AT-hook1蛋白)在12个辣椒品种和13个非辣椒品种中表现出典型的种内非特异性和种间特异性,已有研究表明,该基因为单拷贝。PCR检测的灵敏度达到0.1%,稳定性良好。可以广泛地应用到食品中转基因成分检测。本文进一步讨论了转基因成分检测中存在的问题、转基因产品标识的必要性和目前转基因检测技术在检测中的问题。     

转基因玉米NK603品系成分LAMP快速PCR检测方法的建立

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。     

转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

DP -305423转基因大豆PCR检测方法研究

根据DP- 305423外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,以leetin基因(118 bp)作为内参照基因,筛选最佳引物并对反应程序和反应体系进行优化,最终建立转基因大豆DP - 305423转化体特异性定性PCR检测方法.对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试.结果表明:该方法能够特异性检测出DP...     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文）

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计特异性引物进行PCR检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1142bp的3′端旁侧序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性从MON89788大豆中扩增出170bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

中国马铃薯疮痂病菌快速PCR检测技术

【目的】马铃薯疮痂病菌具有明显的组成多样性,通过筛选不同疮痂病菌的通用探针引物,建立针对该类病原菌的定性检测方法。【方法】以目前中国存在的不同致病种的代表菌株CPS-1（Streptomyces scabies）、CPS-2（S. galilaeus）、CPS-3（S. acidiscabies）、CPS-4（S. turgidiscabies）为材料,根据NCBI GenBank中已登记的疮痂病菌特有毒素合成基因簇中的基因txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）等序列设计引物,对不同菌株的基因组扩增,选择特异性和稳定性较高的引物作为探针引物,经温度梯度筛选优化反应体系后建立成熟的检测技术。【结果】获得的通用检测引物B1/B2对所有致病菌株均表现较好的特异性,可稳定扩出目的条带,而非致病菌株均无条带。利用孢子稀释法验证建立的检测方法对菌株DNA的灵敏度为20 pg•μL-1,对孢子的检测阈值约为4.0 CFU/μL。对测试样品基因组扩增结果表明,疮痂病原链霉菌、病薯样品组织、病田土样均检测到目的条带,而非疮痂病原链霉菌、健康薯块组织、非病田土样和其它菌株均未扩出目的条带,说明该方法的特异性较好。【结论】建立了马铃薯疮痂病菌的定性检测方法,可实现对菌株、病组织和土壤样品的快速检测。     

四重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45

【目的】建立多重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45的方法,为其转基因检测提供技术支持。【方法】选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR检测基因,特异性引物序列参照国家相关标准或文献,通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化、灵敏度测试及已知样品验证,建立抗除草剂转基因油菜T45多重PCR检测体系。【结果】多重PCR的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2,方法灵敏度为0.01 ng/μL,所有已知样品的扩增条带与其分子特征显示的外源基因元件完全一致。【结论】建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分,为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。