草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

薄皮甜瓜果实ACC合成酶cDNA克隆及反义表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(Cucumis melo cv.Qitian I)果肉组织中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到0.7 kb的cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。测序表明,该基因为777 bp,编码258个氨基酸,与Gen-Bank中甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因比对,核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为98%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pCAM2301的E8启动子和NOS终止子之间,构建成E8调控下ACS基因反义表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

黄瓜磷脂酶D基因片段克隆及其反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法,从新泰密刺黄瓜的幼叶中得到长为1018 bp的cDNA片段,编码339个氨基酸,与GenBank中甜瓜磷脂酶D基因相比核苷酸同源性为96%,氨基酸同源性为97%.克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构成磷脂酶D基因的反义表达载体.     

尾叶桉U6 4CL基因cDNA克隆及反义表达载体的构建

[目的]为了获得桉树4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)基因,构建植物反义表达载体,研究4CL基因对木质素的调控机理。[方法]从尾叶桉U6幼茎组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到1.4 kb cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。[结果]测序结果表明,该基因1413 bp,编码471个氨基酸。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121上,构建成4CL反义基因表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导转入根癌农杆菌EHA105,得到完整的Ti质粒表达载体系统。[结论]为该基因转化桉树的主栽品种尾叶桉U6以降低其木质素含量奠定了基础。     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因正反义表达载体的构建

为了改善甜瓜果实的品质及研究甜瓜蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的生物学功能,本试验分别构建了甜瓜果实SPS基因的正义及反义表达载体。用PCR方法将克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用带有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增,然后将该扩增片段克隆到pMD19-T Simple载体上,再用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切,得到该基因编码区3.37 kb的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/XbaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的正义表达载体。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜SPS基因用KpnⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区830 bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的KpnⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜果实SPS基因的反义表达载体。     

黄河蜜甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶基因片段的克隆和反义载体的构建

从伤诱导的黄河蜜甜瓜(Cucumismelocv.Huanghemi)成熟果实的中果皮组织中分离总RNA,经反转录和PCR扩增得到974bp的cDNA片段,克隆到质粒载体pGEM-3zf,经测序与Genbank中甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶(1-amino-cyclopropane-1-carboxylieacidsynthase,ACS)基因同源性为99%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建成ACS基因的反义表达载体。     

马尾松GGPPS基因cDNA序列克隆及正义、反义植物表达载体的构建

以马尾松幼苗针叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因CDS区序列设计特异引物,经RT-PCR技术克隆得到GGPPS基因cDNA序列。克隆片段经酶解后分别正向、反向插入植物表达载体p-GFP,构建成GGPPS基因正义、反义植物表达载体。采用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,建立植物表达载体系统,为下一步植物转化研究过表达、抑制表达GGPPS基因对萜烯类物质合成的影响建立研究基础。     

花生种仁特异表达基因的初步筛选

应用抑制消减杂交技术,以花生种仁cDNA作为消减杂交的试验方(tester),以花生果皮cDNA作为驱动方(driver)进行消减杂交。经过两轮抑制PCR后,将第2次PCR产物与pGEM-TEasy载体相连,电击转化大肠杆菌,成功构建种仁特异表达cDNA文库。所长出菌落中91.2%为白色克隆,采用PCR法对阳性克隆进行鉴定,发现其中单一扩增条带的克隆约占86.5%,片段大小集中分布于200～800 bp之间。用花生种仁cDNA探针和果皮cDNA探针分别对文库高密度杂交点阵膜进行反向Northern杂交检测。根据杂交结果,初步从文库中挑取出254个差异点。花生种仁特异表达基因的初步筛选,为了解花生产量、品质形成相关的重要功能基因,也为将来应用植物基因工程手段改良花生产量和品质奠定基础。     

水稻OsGL1-2基因反义表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术（PCR）扩增水稻OsGL1-2基因反义片段及基因自身的启动子,并分别克隆到pUC19克隆载体上,得到含有OsGL1-2启动子＋OsGL1-2反义片段的中间载体.对重组子进行PCR检测和酶切分析并测序,结果表明,长度分别为417和2 199bp.将OsGL1-2启动子＋OsGL1-2反义片段克隆到植物表达载体pCambia1380多克隆位点,构建了该基因的植物反义表达栽体pCamGL1-2.     

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因克隆及植物表达载体构建

采用RT-PCR方法,从蒺藜苜蓿(Medicargotrunctula)中克隆了二氢黄酮还原酶(DFR)基因cDNA片段,并进行DFR基因植物表达载体的构建.结果表明:扩增的DFR基因片段全长约1 000 bp,编码337个氨基酸,与Gen-Bank中已注册的DFR基因核苷酸序列的同源性为99.80%.以pBI121为基础载体,构建了CaMV35S启动子驱动的DFR基因的植物表达载体pBIDFR,然后导入农杆菌EHA105,经PCR验证确定构建出植物表达载体.     

花生AhFAD2A基因启动子的克隆与序列分析

利用染色体步移技术,从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明,该启动子中含有多种种子特异性表达的元件,如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等,可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。     

花生球蛋白基因克隆及其表达分析

利用噬菌斑原位杂交技术从花生未成熟种子cDNA文库中筛选到一个花生种子贮藏蛋白基因全长cDNA,该cDNA包含一个1 886 bp的开放阅读框,可编码536个氨基酸残基,Northern分析发现,该基因在种子发育早期开始表达,在之后的各个时期表达水平均较高。     

CAV和ALV混合感染病例的诊断

本实验从10羽130日龄发病海兰白蛋鸡中分离组织病料,并进行药敏试验及PCR诊断。根据CAV、ALV已有引物,通过PCR方法检测,结果显示:样本均能扩增出584bp和1260bp的片段,即CAV和ALV均为阳性,确诊为CAV与ALV混合感染。测序结果显示,同源率分别可达97.3%～99.1%和98.3%～99.4%。     

奶牛白细胞介素-2基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的牛IL-2(M13204)基因序列,应用Primer Premier5引物设计软件自行设计一对引物,以ConA刺激培养24 h的奶牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出奶牛IL-2基因,然后测序.结果表明克隆的奶牛IL-2基因大小477 bp,编码158个氨基酸,与GenBank上发表的牛IL-2基因序列比较,其核苷酸的同源性99.4%,与马、猪、猫、狗、山羊、绵羊的核苷酸的同源性分别为31.8%,32.0%,31.6%,30.3%,30.8%,31.0%.     

花生种皮中一种NBS类抗病基因的克隆与序列分析

利用植物抗病基因核苷酸结合位点（NBS）的保守区设计一对特异引物,以抗、感黄曲霉病花生品种J11和金花1012的种皮基因组DNA和RNA为材料进行DNA-PCR和RT-PCR扩增,经克隆、测序,得到一条504 bp的目的片段pnbs1,在GenBank上的登录号为GQ199610。Blast和Blastx分析发现pnbs1核苷酸序列与C8V1G10F抗性蛋白的核苷酸序列的同源性为89%,与抗性蛋白PLTR的氨基酸序列同源性为59%。该片段的氨基酸序列中含有抗病基因NBS区域的3个保守模体：GPGGVGKTT、KKFFIVLDDVW和STILLTTR,推测pnbs1可能是花生NBS类抗性基因的核心区域。     

云南花生丛枝植原体secY基因序列分析及结构预测

 对采自云南元谋的花生丛枝植株总DNA进行secY基因的巢式PCR扩增,得到约1700bp的特异扩增片段,将该扩增产物克隆后进行序列测定,表明该片段长1709bp,该序列包括部分rpl15基因、全部secY基因序列以及部分的map基因,为植原体部分spc核糖体蛋白操纵子,其中secY基因编码的蛋白包括420个氨基酸,为含有10个明显跨膜区的整合性跨膜蛋白。通过同源性比对及构建的系统进化树,表明该株系与来源于台湾、海南的花生丛枝植原体亲缘关系最近,确定了该株系属于16SrII A亚组成员。该分类结果与基于16SrDNA及rp基因的分析结果一致。     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

致病疫霉菌无毒基因AVR3a的克隆与序列分析

根据GenBank中致病疫霉菌无毒基因AVR3a序列（AJ893357）及参考文献中的特异引物（Pex147F,Pex147R）,以致病疫霉菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到了特异性扩增片段,并对特异片段进行纯化和测序。结果表明,该片段的长度为451bp,经序列分析表明,其氨基酸编码序列为441bp,共编码147个氨基酸。BLAST分析结果显示,该片段核苷酸序列与无毒基因AVR3a核苷酸序列的同源性为99．34％,氨基酸序列比对结果表明,氨基酸序列在第19、80和103位存在着差异,这些核苷酸序列差异以及某些关键氨基酸的改变有可能是导致不同菌株中AVR3a毒性变异的原因。     

矮牵牛花色CHS-A基因启动子(Pchsa)的克隆及序列分析

根据国外报道,矮牵牛花色相关基因CHS-A的启动子Pchsa具有花期特异性启动子的活性,人工合成2个特异性引物并从矮牵牛基因组中经PCR分离出长约500 bp的DNA片段,经纯化后测序得到499 bp的目的片段。在NCBI中通过BLAST程序与序列号为S52984的PchsA比较,其同源性为95.73%。应用DNAMAN软件进行序列分析,结果表明该片段除含有启动子的保守序列TATA-box、CAAT-box、GC-box、G-box外,还含有花期特异表达的启动序列TACPyAT-box。这为该序列在花卉改良中的进一步运用奠定了基础,同时也证明不同品种间的PchsA存在差异。