光裸星虫SERCA基因克隆及在卵母细胞中的表达分析

细胞内钙离子(Ca²⁺)浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素。肌质网/内质网Ca²⁺-ATP酶(Sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase, SERCA)属P型ATP酶家族成员,是细胞内Ca²⁺转运的重要调控蛋白。前期转录组分析显示,光裸星虫(Sipunculus nudus) SERCA (Sn-SERCA)的表达量在卵母细胞发育过程中差异显著,为进一步研究SERCA在卵母细胞不同发育阶段中的作用,利用RACE技术得到Sn-SERCA cDNA全长,采用实时荧光定量PCR检测SnSERCA在各卵母细胞发育时期的相对表达量。结果表明,Sn-SERCA全长为3 840 bp,5’非编码区(UTR)为196 bp,3’UTR为581 bp,开放阅读框3 060 bp,编码1 020个氨基酸,Sn-SERCA具有P型ATP酶家族进行催化反应所需的两个保守基序“TGES”和“DKTGT”。多序列比对、Motif分析及三级结构预测结果显示SERCA同源...     

真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5’非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3’UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。     

青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析

为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

大菱鲆热休克蛋白90基因cDNA的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到HSP90,采用基因克隆方法获得含有1个97bp的5’UTR、2190bp的开放阅读框和501bp的3’UTR的全长cDNA序列。整个开放阅读框编码729个氨基酸,包含HSP90家族5个保守信号区。与其他物种已知序列同源比对的结果显示,此编码氨基酸更接近于热休克蛋白90β亚型(HSP90β),与牙鲆HSP90β的同源性高达96.6%。RT-PCR分析表明,在胚胎发育初期就能检测到HSP90,其表达量伴随着胚胎发育,先增加后减少,在尾芽期达到最高。HSP90在健康大菱鲆各供试组织中均有表达。经鳗弧菌感染处理后,在胚胎细胞中也有HSP90的强烈表达。结果显示,大菱鲆HSP90cDNA序列为HSP90β,是一种组成型表达的基因,其在维持正常生理机能、胚胎发育和应激中发挥重要的作用。     

中国沿海光裸方格星虫6个地理群体遗传多样性分析

为科学保护和开发我国光裸方格星虫自然资源,本研究以cytb基因全长为分子标记分析了山东烟台、福建古雷、香港、海南儋州、海南陵水、广西东兴6个光裸方格星虫群体的遗传多样性。结果显示,203个个体共检出128个单倍型,299个多态位点,核苷酸多样性和单倍型多样性分别为0.0488和0.9773,且变异主要来自群体间(88.4%)。6个光裸方格星虫群体间遗传分化指数(F_(st))分析结果显示,南方5个群体间F_(st)0.15,基本无分化或呈低度分化;而烟台与南方5个群体间的固定指数都很大,F_(st)0.15,群体间呈高度分化。中性检验(Fu’s Fs、Tajima’s D)结果为负值,北方群体和南方群体的核苷酸错配分布图为单峰,单倍型网络分布图为以主单倍型为中心的放射状结构。用203条cytb序列构建的系统发育树显示,烟台群体聚为一个进化支,南方群体聚为一个进化支。研究表明,中国沿海的光裸方格星虫群体在历史上经历过大规模群体扩张,但目前遗传多样性较低,说明光裸方格星虫对环境变化的适应能力较差,应加强野生资源的保护,在进化关系上,烟台群体与其他5个群体之间存在较大的遗传分化,但是否已经形成隐秘种仍需进一步的研究。     

仿刺参性别相关基因P450c17的克隆与序列分析

本研究克隆了仿刺参(Apostichopus japonicus)P450c17基因的全长cDNA,结果表明其cDNA的5′端UTR为256 bp,3′端UTR为250 bp,ORF为1 530 bp。在3′端有特殊序列ATTTA、终止密码子TAA和polyA加尾。其全长cDNA编码509个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子量57.6 kD,理论等电点5.5。P450c17的氨基酸序列存在长度为25个氨基酸的信号肽,1个长度为22个氨基酸的跨膜区,1个糖基结合位点NHS,1个P450特有的结构域,其氨基酸序列具有明显的细胞色素P450基因家族的特征。结构域中亚铁血红素结合域中的精氨酸R和发挥活性所必须的半胱氨酸C都是保守的。这些结构组成了血红素结合环、质子传递槽和K螺旋及绝对保守EXXR基序。蛋白前体二级结构中无规则卷曲占41.22%,延伸链占12.77%,α–螺旋占46.01%,不含–折叠。氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源性在35%～41%之间。系统进化树表明仿刺参与长牡蛎(Crassostrea gigas)及文昌鱼(Branchiostoma belcheri)聚为一支,黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、鲇(Clarias gariepinus)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)及白斑角鲨(Squalus acanthias)聚为一支,三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、金眼门齿鲷(Stenotomus chrysops)、斑马鱼(Danio rerio)、鲤(Cyprinus carpio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆及青鳉(Fundulus heteroclitus)聚为一支。研究结果为进一步探讨仿刺参P450c17在性激素调控性别分化方面的功能提供参考。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析

克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5′端)和208 bp(3′端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。     

海南沿海光裸方格星虫生态习性及其资源保护

<正>光裸方格星虫(Sipunculus nudus)又名"沙虫",其肉质脆嫩,味道鲜美。隶属于星虫动物门、星虫纲、方格星虫目、星虫科、方格星虫属。在海南有不少的沿海,滩涂广阔,水质良好,沙质底或沙泥质底,尤其适宜光裸方格星虫的生长,光裸方格星虫分布广泛。其主要分布区的临高马袅和儋州光村一带沿海滩涂,上个世纪90年代以前,这些沿海滩涂光裸方格星虫资源十分丰富,当地妇女常下海采捕,其捕获量亦相当可观。但是近十     

高温胁迫下刺参肠道细胞应激颗粒标记蛋白TIA-1的表达特征

产生应激颗粒是生物体遭受不利环境时细胞产生的一种自我保护机制,基于此,本研究开展了高温胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)肠道细胞中应激颗粒(Stress granule)标记蛋白基因TIA-1表达特征的研究。采用RACE技术克隆了刺参T细胞胞内抗原-1基因(TIA-1)全长c DNA序列。该基因c DNA全长为3108 bp,包括16 bp的5'UTR,1284 bp的开放阅读框(ORF),1808 bp的3'UTR,编码427个氨基酸。结构分析表明,刺参TIA-1基因编码3个N末端RNA识别基序(RRM)和2个类似蛋白聚集区的C末端区域(low complexity)。系统进化树分析表明,刺参TIA-1与软体动物门鸭嘴海豆芽(Lingula anatina)TIAR聚为一支,具有最近的亲缘关系。使用Western blotting技术检测目的蛋白TIA-1在全细胞和亚细胞成分中的表达差异,并且利用细胞免疫荧光技术检测细胞在高温胁迫下TIA-1的定位情况。研究结果表明,刺参肠道细胞TIA-1在高温胁迫下在细胞质中表达量显著上升(P0.05),且高温胁迫下TIA-1定位表达发生变化,多分布在细胞核周围,由此推断TIA-1在刺参高温应激时可能参与了应激颗粒的生成,从而对刺参肠道细胞起到了保护作用。     

光裸方格星虫繁殖习性的初步观察

2011年6、7、8月每月10日,挑选♀∶♂为5∶1的性成熟光裸方格星虫(Sipunculus nudus)亲体,在水泥池中暂养20 d,观察其产卵习性、产卵量及其体腔中生殖细胞的变化。结果表明,光裸方格星虫雌雄异体、体外受精;卵母细胞分批成熟,分批产卵;产卵时间不固定,昼夜皆可产卵,但夜间产卵次数和产卵量均高于白天;大量产卵时集群游动;6、7、8月的雌光裸方格星虫平均产卵分别为:3.20×104、4.43×104、3.46×104cell,平均受精率达98.3%;6、7、8月日累计产卵量y与时间x的变化方程分别为:y=0.430 5x3-25.971x2+503.39x-582.56(R2=0.982 0)、y=0.583 3x3-33.942x2+659.04x-712.43(R2=0.984 7)、y=-0.31x3+1.4676x2+245.11x-278.22(R2=0.994 3)。6、7、8月成熟卵细胞相对百分含量分别降低4.8%、9.0%、26.0%(P<0.01);6、7月的光裸方格星虫产后具有较好的再繁殖能力。     

重金属Cu~(2+)、Cd~(2+)对光裸方格星虫的急性毒性效应

为探讨重金属离子Cu~(2+)、Cd~(2+)对光裸方格星虫的急性毒性效应,设置了6个浓度梯度和3个处理时间,观察记录方格星虫死亡情况及组织形态图检。结果表明:1)在具有一定Cu~(2+)和Cd~(2+)浓度处理中的光裸方格星虫均呈现中毒现象,光裸方格星虫的死亡率随着重金属离子浓度的增加和处理时间的延长而逐渐升高,具有明显的剂量与时间效应。2)Cu~(2+)对光裸方格星虫的毒性大于Cd~(2+),Cu~(2+)对光裸星虫的48 h LC_(50)和72 h LC_(50)值分别为10.60mg/L和4.36 mg/L,Cd~(2+)的48 h LC50和72 h LC_(50)分别为11.95 mg/L和5.76 mg/L。3)光裸方格星虫的食道及胃肠道是重金属离子的主要侵害部位,也是较先受到毒性作用的部位。     

湛江近海海域裸体方格星虫消化系统的剖析

本文为探索湛江近海海域裸体方格星虫的消化系统特点,以湛江近海海域裸体方格星虫为材料,对其消化道的形态和组织学进行了切片剖析。结果表明,裸体方格星虫消化系统由口、咽、食道、肠、直肠、盲肠和肛门等组成;在直肠上附有直肠盲囊,其消化道约为体长的2.5倍,肠道通过3个回折及螺旋缠绕形成肠索;消化道管壁由内向外分为黏膜层、黏膜下层和浆膜层,黏膜层有大量的皱褶,没有连续肌肉层,而黏膜下层由结缔组织组成,含有肌纤维和血管神经等;裸体方格星虫消化道有发达的纤毛,直肠盲囊连接于直肠末端,里面充满黄色液体。     

两种不同粒径海沙中培育裸体方格星虫中苗效果比较

本文报道了2010年至2011年,采用两种粒径不同的海沙培育裸体方格星虫中苗的效果比较。结果表明,星虫苗在粒径250～500μm的海沙中养殖,比在粒径63～250μm的海沙中养殖更具有明显的生长优势和较高的存活率。铺设适宜粒径的海沙是提高裸体方格星虫苗种中间培育生长率和存活率的重要因素。     

不同地理群体裸体方格星虫遗传结构及种群分化研究

本研究对福建长乐、古雷、晋江海区裸体方格星虫自然群体91个个体的线粒体COI基因进行序列测定,并与厦门、北海、三亚3个地理群体15个个体的线粒体COI基因序列进行了比较分析。在106个个体中共发现193个核苷酸多态位点和52个单倍型,长乐、古雷、晋江海区3个地理群体中单倍型多样性指数(h)在0.626到0.972之间,核苷酸多样性(π)在0.00155到0.01325之间,表现出较高的遗传多样性。分子方差分析(AMOVA)显示1.97%的变异存在于群体内,而群体间的遗传变异为98.03%,群体间变异是总变异的主要来源。构建的单倍型系统关系树显示单倍型聚合为A、B、C、D 4个不同的具有高支持率的分支,表明我国沿海至少存在4个线粒体具显著差异的类群,并可能存在隐蔽种。单倍型最小拓展网络图揭示裸体方格星虫类群A存在福建沿海和北部湾两个明显的分支,是否可提升为亚种有待进一步考证。研究结果为中国沿海裸体方格星虫种质资源保护、人工苗种放养及遗传育种工作的开展提供了依据。     

东寨港翡翠贻贝、红肉河蓝蛤和光裸星虫消化酶的研究

对东寨港3种不同生长阶段几种大型底栖生物的消化酶活力进行了研究，结果表明，淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和胃蛋白酶活力随着个体在不同底栖生物生长阶段中呈现出不同的变化：（1）翡翠贻贝（Perna viridis Linnaeus)消化酶活力的研究结果表明，淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活力随着个体的生长不断增大。（2）红肉河蓝蛤（Potamocorbula rubromuscula Zhuang and Cai)的研究结果表明，淀粉酶，胃蛋白酶和脂肪酶活力随着个体的生长不断减小，纤维素酶活力随着个体的生长不断增大。（3）光裸星虫（Sipunculus nudus Linnaeus)的淀粉酶和纤维素酶的活力随着个体的增大而增大，脂肪酶活力随着个体的增大而减小。     

裸体方格星虫规模化人工育苗技术研究

本文报道了2008～2011年在福建开展裸体方格星虫规模化人工育苗技术研究结果。每年3～5月从福建沿海采集一定数量的裸体方格星虫亲体,经强化培育后进行人工催产获得受精卵。在海水盐度26～32、水温28.5～30.5℃条件下,孵出的海球幼体经9～13d的培育,变态为稚虫,再经过一个多月的培育,达到体长1.0～2.8cm的星虫幼苗。2008、2009、2011年分别培育出方格星虫幼苗1.779×106条、2.88×106条和5.526×106条。     

鱼类卵子发育与卵泡闭锁的研究进展

鱼类种群繁衍离不开优质卵子的产出.卵子质量问题限制了许多海洋和淡水鱼类养殖业的发展.卵子质量主要受卵黄形成与卵母细胞发育的影响.亲本营养、管理以及其他内源或外源因素可能会影响卵黄组成与卵泡发育.与哺乳动物相比,鱼类卵母细胞发育与调控机制的研究尚不清晰.本文分析了鱼类卵子发育特点,探讨了亲本来源、育龄、环境因子以及营养等...     

Immunohistochemical observations of vitellin synthesis and accumulation processes in ovary of Ezo abalone <Emphasis Type="Italic">Haliotis discus hannai</Emphasis>

Ovarian follicle cells are the site of yolk protein synthesis in the Ezo abalone Haliotis discus hannai. In this study, histological observations of ovarian follicle cells were conducted in H. discus hannai by immunocytochemical and in situ hybridization methods focusing on their function of yolk protein synthesis. An antibody raised against purified yolk protein (vitellin, Vn) recognized yolk granules in oocytes, and ovarian follicle cells adjacent to the oocytes under yolk accumulation were stained positively with both anti-Vn antibody and an antisense probe for vitellogenin (the precursor for vitellin, Vtg) mRNA. These results indicate that the abalone Vtg gene is transcribed and translated in the ovarian follicle cells. In oocytes in the early phase of yolk accumulation, positive reactions with the antibody appeared first in the stalk part, and the follicle cells adjacent to the stalk were also stained positively. These observations imply local transport of yolk protein from the follicle cells to the oocyte through an extracellular space around the oocyte stalk. Ovarian follicle cells changed their morphological characteristics and reactivity to the antibody in close relation to the stages of the adjacent oocyte, which suggests the presence of functional interactions between follicle cells and oocytes in the course of yolk protein synthesis and accumulation.     

方格星虫的繁育、养殖及研究开发进展

方格星虫（Sipunculus nudus）是中国重要的经济类底栖动物,具有重要的食用价值和药用价值。由于近年来过度捕获造成自然资源匮乏,亟待养殖技术和繁育技术的提高以满足食用和药用研究需求。关于方格星虫的研究目前多集中在繁殖发育、营养和药用价值等方面。目前方格星虫的繁育技术已经初步成功,其养殖规模有望扩大,但是其生产方式和池塘养殖技术仍有待深入研究。文章综述了有关方格星虫分类、养殖生态、繁育、营养及其增养殖技术等方面的研究,以期为方格星虫养殖产业的发展与研究开发提供参考。