利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱

在建立可靠的苜蓿基因组DNA提取分离和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD、SSR和ISSR引物,建立苜蓿基因组DNA的SSR、ISSR和RAPD分子标记技术体系,并利用分子标记检测苜蓿品种(系)的DNA分子标记多态性,构建苜蓿品种的DNA指纹图谱.筛选出36个RAPD引物,8个SSR引物和12个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(系)中获得了182个RAPD多态性位点和丰富的SSR和ISSR多态性位点,构建了55个苜蓿品种(系)的SSR、ISSR和RAPD指纹图谱.结果表明,不同苜蓿品种(系)的SSR多态性有较大差异;苜蓿品种ISSR指纹图谱多态性丰富,稳定性比RAPD强;可以通过2～3个引物鉴别我国主要苜蓿品种和引进品种,SSR和ISSR指纹图谱可以更好地用于苜蓿品种鉴定和遗传多样性分析.     

苜蓿假盘菌的生物学特性研究

摘要：本试验研究了温度、水分、pH值、光照、碳源、氮源以及无机盐对苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)宁夏菌株生物学特性的影响。结果表明,苜蓿假盘菌宁夏菌株在5～30 ℃、pH值4.0～10.0均可生长,最适温度为20～25 ℃,最适pH值为5.0～6.5,该菌随光照强度的增加生长受到抑制,能利用固体培养基上不同的碳源,对葡萄糖和麦芽糖的利用较好。除尿素抑制病菌的生长外,该菌能不同程度利用无机氮源和有机氮源,菌落直径和生长速率基本一致,差异不明显,但菌落数差别较大,无机氮源优于有机氮源。供试的4种盐溶液除KH2PO4没有菌生长外,其余3种生长量基本一致,但4种盐溶液下生长的菌落均不产生子囊盘。叶片表面的游离水及游离水保持的时间可影响孢子的萌发,且叶表游离水保持3 h以上,孢子才能萌发。     

苜蓿假盘菌致病力分化研究

从我国苜蓿(Medicago satiua)品种资源中首次成功筛选出9个具有栽培代表性的品种,即宝鸡苜蓿、泾阳苜蓿、沙湾苜蓿、沙河苜蓿、晋南苜蓿、天水苜蓿、龙牧一号、保定苜蓿和伊鲁瑰斯,作为苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)的生理分化鉴别寄主。采用室内接种盘倒扣接菌法,根据在鉴别寄主上的发病等级,将采自我国苜蓿主产区的7个苜蓿褐斑病菌菌株划分成5个致病类型,其中致病类型A为强致病类型,致病类型E为弱致病类型,C、D和G组致病类型介于两者之间。研究结果为我国苜蓿品种抗性鉴定、苜蓿褐斑病流行监测和品种合理布局提供了理论依据。     

苜蓿假盘菌分离方法及培养性状比较研究

采用离心稀释法和叶面弹射法分离苜蓿假盘菌,结果表明离心稀释法能够得到纯化的菌落,而叶面弹射法能弹射出单个或成对的孢子,但无法获得菌落。南疆菌株在4种培养基上的培养性状与北疆菌株存在显著差异,尤其体现在子囊盘大小指标上,南疆菌株为147.22～199.34μm,而北疆菌株为96.29～14.74μm,在形成菌落所需的时间、菌落颜色等方面也存在一定差异。研究表明V-8苜蓿汁培养基最有利于菌落生长和孢子成熟。     

苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征

从细胞角度揭示苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作机制。以两者亲和性互作系统为研究材料,利用透射电子显微镜技术研究了苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征。结果表明,病菌侵入寄主组织后,菌丝直接穿透寄主细胞壁进入寄主细胞形成胞内菌丝,以胞内生长并向相邻细胞扩展。病菌菌丝穿透寄主细胞壁时,菌丝中的液泡给予了较大的压力帮助其穿透。进入寄主细胞内的病菌菌丝,被内陷的寄主原生质膜包裹,菌丝与质膜始终是隔离的,寄主原生质膜和细胞壁之间沉积电子致密度深的物质。病菌菌丝不断地在寄主原生质膜区域扩展,伴随菌丝体在寄主细胞内的不断扩大,周围的原生质膜也相应扩大其面积,但始终将寄主原生质与菌丝体隔开,而脱离质膜的菌丝形成菌丝鞘包裹。随侵染程度的增加,未被穿透的寄主原生质膜区域逐步被降解。病菌侵染叶绿体等细胞器时,首先是菌丝鞘与叶绿体等细胞器膜相连,然后降解其基粒片层结构,被降解的细胞器组织沿菌丝和胞壁周围沉积。侵染后期,菌丝胞内和胞外扩展,但处在细胞降解物中的菌丝显示较厚的细胞壁,寄主细胞内充满了大量的黑色物质和结晶状的颗粒物。     

淮阴苜蓿SSR指纹图谱的构建

采用不同的取样策略,利用SSR分子标记研究淮阴苜蓿（Medicago sativa Huaiyin）遗传多样性,确定最佳取样数,在此基础上利用筛选的SSR引物构建淮阴苜蓿的指纹图谱,并对淮阴苜蓿进行品种鉴定。本研究对320株淮阴苜蓿的单株基因组DNA设置6个处理（10、20、30、40、50、60单株DNA随机等量混合）,每处理8个重复,利用筛选的4对SSR引物进行遗传多样性分析。结果表明,40株单株随机DNA的混合样品的遗传多样性指数开始趋于稳定,由此取40株即可代表淮阴苜蓿群体。采用取样数为40株单株DNA混合样,利用筛选的3对SSR引物构建淮阴苜蓿指纹图谱,并对15份供试苜蓿材料进行检测,结果表明,该方法所构建淮阴苜蓿SSR指纹图谱可以用于对淮阴苜蓿品种的鉴定。     

五种不同苜蓿的种子蛋白指纹图谱研究

采用8%和10%两个浓度梯度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对黄花苜蓿、天蓝苜蓿、一年生苜蓿(Orion)、紫花苜蓿(敖汉)及1个紫花苜蓿杂交种共5种不同苜蓿的种子可溶性蛋白和盐溶蛋白图谱进行了研究。结果显示:5个种10%和8%凝胶电泳的种子可溶性蛋白总带数分别为97和91,10%凝胶电泳的种子盐溶蛋白共有69条谱带;5种苜蓿在种子可溶性蛋白和盐溶蛋白电泳图上都具有各自的特征谱带,谱带数目、位置、宽窄和颜色深浅都存在明显的差异;10%凝胶的可溶性蛋白指纹图谱谱带数目相对较多,种间遗传差异在A、B、C区均有分布,谱带的重复性好,是鉴别种的最好图谱。5种苜蓿种子可溶性蛋白和盐溶蛋白指纹图谱一致,表明杂交种和敖汉苜蓿的谱带相似性最大,与黄花苜蓿的相似性次之,而这3个种与天蓝苜蓿和一年生苜蓿(Orion)的相似性较小。这与种在形态学上表现出来的差异相一致,从而进一步肯定了采用种子贮藏蛋白电泳技术进行苜蓿分类研究和种子鉴别的可靠性。     

苜蓿DUS测试标准品种SSR分子标记指纹图谱的构建

苜蓿在育种过程中,由于其异花授粉特性和骨干亲本的集中使用,导致品种间的遗传差异日益缩小,品种之间通过形态学鉴定愈加困难。通过构建苜蓿DUS测试标准品种DNA指纹图谱数据库,可以实现苜蓿品种的快速、准确鉴定。本研究利用筛选得到的10个SSR标记对33个苜蓿DUS测试标准品种进行指纹图谱构建和遗传多样性分析。结果表明,10对SSR引物共扩增出69个等位基因,平均每个标记可产生6.9个等位基因;多态性比率(PPB)从25%到90%不等,平均值为56.7%;各SSR标记的多态信息含量(PIC)范围为0.56~0.87,平均值为0.75。利用不同引物间的组合能有效区分33个苜蓿 DUS标准品种,并为每份标准品种建立了唯一标识的指纹代码,为苜蓿品种的审定和保护以及遗传背景分析提供了技术依据。     

不同抗性苜蓿株系叶片感染假盘菌后酶活性的变化

采用活体整株接菌法研究苜蓿高抗褐斑病株系DR1111和高感株系DS10在假盘菌诱导不同时间(0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d、15d、20d)后叶片多胺氧化酶(PAO)、二胺氧化酶(DAO)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化。结果表明,接种假盘菌后高抗病株系和高感病株系的四种酶活性均有提高,接菌后20d内酶活性变化基本上呈先升高再降低的趋势,高抗株系的DAO活性显著高于高感株系(P<0.05),感病株系的SOD活性在第3~10d显著高于抗病株系(P<0.05);高抗株系的PAO和DAO活性峰值出现早于高感株系,而高抗株系的CAT活性峰值则晚于高感株系。     

海南岛红毛丹种质资源DNA指纹图谱构建

分别利用筛选出的多态性高、谱带清晰的8条ISSR标记和18对SRAP标记对海南岛69份红毛丹种质资源进行PCR扩增,8条ISSR引物共检测到425个多态性条带,其中品种(系)特异条带47个,平均位点多态性信息含量(PIC)值为0.928,可鉴别的种质资源数25～67份;18对SRAP引物共检测到894个多态性条带,其中品种(系)特异条带69个,平均位点多态性信息含量(PIC)值为0.936,可区分的种质资源数为17～63份。综合各项指标利用ISSR16和ISSR5引物21个条带用于构建红毛丹种质DNA指纹图谱,该图谱可有效区分69份红毛丹种质资源。同时该DNA指纹图谱还可为下一步红毛丹种质资源鉴定、利用、品种权保护和分子育种等提供了理论依据。     

苜蓿褐斑病菌离体叶片接种方法及侵染途径观察

筛选比较了5种苜蓿褐斑病菌离体叶片接种技术,结果表明,逆向产孢培养技术是苜蓿褐斑病的理想接种方法。利用扫描电镜,对逆向产孢培养技术离体接种的苜蓿假盘菌（Pseudopeziza medicaginis）子囊孢子侵入途径观察发现：接种到叶片上的子囊孢子4 h后开始萌发产生芽管以直接侵入的方式侵入寄主表皮细胞,侵入前不形成附着胞等侵染结构,未观察到子囊孢子由气孔侵入。     

苜蓿褐斑病对紫花苜蓿光合作用及草品质的影响

为确定褐斑病对紫花苜蓿光合作用和草品质的影响,以便确定此病的重要性,选取了发生该病不同严重度的植株,用LI-6400光合仪测定了5个光合作用指标,采集不同严重度的叶片和茎秆,分别测定了10个营养成分指标。结果表明:以健康无病植株为对照,随发病严重度的增加,紫花苜蓿叶片中粗灰分(Ash)、酸性洗涤纤维(ADF)含量分别增加19.94%、71.21%,与严重度的相关系数均为0.95;中性洗涤纤维(NDF)、钙(Ca)、单宁及总酚含量分别增加39.68%、136.42%、21.93%、50.55%,与严重度的相关系数分别为0.91、0.85、0.89、0.85;粗蛋白(CP)、钾(K)含量分别减少15.67%、29.91%,与严重度的相关系数分别为-0.99、-0.86;粗脂肪(EE)、磷(P)含量减少,与严重度相关性不显著;茎秆中Ash、NDF感病后含量下降,其他品质指标与叶片感病后变化趋势一致;胞间CO₂浓度(C_i)升高,与严重度相关性不显著;净光合速率(P_n)、蒸腾速率(E)分别下降93.27%、68.34%,与严重度的相关系数分别为-0.82、-0.86;气孔导度(G_s)与水分利用效率(WUE)亦呈下降趋势但差异不显著,与严重度相关性不显著;P含量与5个光合指标均无显著相关性;其他品质指标均与P_n、E有极显著或显著相关性。主成分分析表明:第一主成分可以代表80.94%不同严重度褐斑病苜蓿品质和光合作用的变异信息,主要有Ca、K、Ash、单宁、总酚、E、P_n、ADF、NDF、CP、C_i、EE、WUE、G_s等指标。表明褐斑病影响紫花苜蓿光合作用,进而影响草品质。     

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol·L^-1dNTP,0.5μmol·L^-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol·L^-1MgCl₂;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L^-1dNTP, 0.5 μmol·L^-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L.)ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl₂,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃(62℃~58℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃;94℃变性30 s,52℃(52℃~48℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。     

鹰嘴豆ISSR反应体系的正交优化

鹰嘴豆(Cicer arietinum)ISSR反应体系的建立可以为鹰嘴豆种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位提供理论依据和技术参考。本研究以CTAB法提取的鹰嘴豆DNA为模板,采用L₁₆(4⁵)正交设计直观分析法,对鹰嘴豆ISSR-PCR反应中的4个主要因素(Mg²⁺浓度,引物浓度,TaqDNA聚合酶浓度,dNTPs浓度)在4个水平上进行优化,并在最优ISSR-PCR反应体系的基础上对引物UBC826的最适退火温度进行筛选。结果表明:Mg²⁺和引物浓度对PCR扩增结果有显著影响,dNTPs和Taq酶的浓度变化对PCR扩增结果无显著影响。鹰嘴豆ISSR-PCR优化反应体系(25 μL)为:3 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.24 μmol·L^-1引物,2 U Taq DNA聚合酶。UBC826最适退火温度为56℃。     

东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

溶氧因素对冬虫夏草摇瓶培养的影响

对冬虫夏草菌丝体摇瓶培养中影响溶氧的主要因素进行分析。通过测定不同摇床转速、装液量、封口方式下摇瓶培养后的菌丝得率,并对其进行单因素分析,选择单因素较优水平,然后进行3因素正交试验。结果表明,最适宜溶氧条件为摇床转速140r/min、装液量50%、封口采用无菌培养容器封口膜;各因素影响培养的显著性依次为摇床转速、装液量、封口方式;不同摇床转速下对有效成分含量测定显示,摇床转速对虫草多糖及虫草酸含量影响不显著。     

本氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立及引物筛选

以CTAB法提取的本氏针茅(Stipa bungeana Trin.)基因组DNA为模板,采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,对影响本氏针茅ISSR-PCR反应体系中的DNA、Taq酶、dNTPs、引物和Mg2+进行优化,旨在建立适合本氏针茅ISSR-PCR分析的最佳反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中各组分的浓度分别为:DNA(20ng/μL)2.5μL、Taq DNA酶(5U/μL)0.1μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL、引物(10μmol/L)2.3μL、Mg2+(25mmol/L)1.4μL、10×Buffer 2.5μL、ddH2O 9.6μL。经过体系验证和引物筛选试验表明该体系适于本氏针茅遗传多样性分析,该体系的建立为本氏针茅种质资源遗传多样性研究提供了理论基础。     

水分胁迫及复水对达乌里胡枝子酶促防御系统影响

选用来自山西的6个生态型达乌里胡枝子(Lespedeza davurica)在干旱胁迫和复水后,研究植物叶片含水量、膜脂过氧化物和保护酶活性变化来探索不同生态型达乌里胡枝子在水分胁迫下和复水后酶促防御系统与抗旱性关系。结果表明:随干旱胁迫时间延长,达乌里胡枝子的叶片相对含水量和植株相对生长率逐渐下降,脯氨酸含量和丙二醛(MDA)含量上升,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性先升高后下降。复水后,各指标均有不同程度恢复,SOD、POD、CAT 3种酶活性比复水前低,而且比对照低,降低幅度最大的是SOD酶,其次是CAT和POD酶。干旱胁迫下,抗旱性强的阳泉、交口生态型MDA积累少,细胞膜受到伤害较轻,3种酶彼此协调保持酶系统的防御能力较强。抗旱性弱的沁水、沁源生态型MDA积累较多,细胞膜受到伤害较重,POD、CAT两种酶相互协调作用,而SOD同POD、CAT协调性较差。6个生态型达乌里胡枝子的抗旱性由强到弱顺序是:阳泉>静乐>太谷>交口>沁水>沁源。