猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除载体的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因缺失细胞系和进一步明确CD163在PRRSV感染过程中的作用,本研究以猪基因组为模板,扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因同源左臂和同源右臂,并将扩增片段与pGEM-T载体连接后进行部分序列测定,同时与已知相应片段进行同源性分析,再将扩增的同源左右臂分别酶切后定向连接至pSSC-9载体中,成功构建了含Neo和Tk基因的双标记打靶载体pSSC-Larm-Sarm。     

RNAi抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是世界上主要的猪传染性疾病之一,以妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难,类流感症状、发育迟缓为主要的特征。该病给各个国家的养猪业带来巨大的经济损失,目前,疫苗和抗病毒药物只能提供有限的保护。自2006年以来,不断有研究者应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术开展抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究,并取得了一些阶段性成果。对已有的研究成果进行了综述。     

中药体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

采用细胞培养的方法测定了细胞安全浓度范围内的自拟药方（抗病毒合剂）抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的作用。结果表明,抗病毒合剂有较强的抗病毒作用,并呈一定的量效关系。先加药物后加病毒时,46.88～6000μg/ml范围内作用显著、93.75μg/ml的作用最好;先加病毒后加药物时,375～6000μg/ml范围内作用显著、6000μg/ml的作用最好。这可能是抗病毒合剂治疗猪繁殖与呼吸综合征等病毒病的机理之一。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法.     

16种中药体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

To observe the antiviral action of 16 kinds of Chinese medicinal herbs (Houttuynia cordata Thunb,Flos Chrysanthemi,Flos Lonicerae Confusae,Anemarrhena asphodeloides,CassiaTwig,Herba Ephedrae,Radix Paeoniae Rubra,Bupleurum chinense,Dryopteris setosa,Folium Isatidis, Gardenia jasminoides Ellis,Mntha haplocalyx Briq,Paeonia suffruticosa Andr,Cornu Bubali, Herba Senecionis Scandentis,Radix Gentianae) against porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）, the blocking, inhibiting and killing roles were detected in present study in vitro. The results showed that 13 kinds of Chinese medicinal herbs had antiviral actions against PPRSV except Paeonia suffruticosa Andr, Herba Senecionis Scandentis and Folium Isatidis, and Houttuynia cordata Thunb, Flos Chrysanthemi, Anemarrhena asphodeloides, CassiaTwig and Radix Paeoniae Rubra exhibited the best antiviral actions followed by Herba Ephedrae, Bupleurum chinense and Dryopteris setosa.     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究概况

猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状的急性热性接触性传染病。该病是威胁养猪业的主要传染病之一,给养猪业带来极大危害。目前对该病缺乏有效的治疗手段,疫苗免疫接种是主要的防控措施。尽管市场上的灭活疫苗和弱毒活苗具有一定的保护作用,但都存在一定局限性。基因工程疫苗具有生产工艺简单,安全高效等优点,但仍处于实验室研究阶段。论文对猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展进行综述,以供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。已几乎遍极世界所有养猪国家,在中国的流行和分布也日益广泛,危害日益严重。此病的传播给世界养猪业造成严重经济损失,受到国内外学者的高度重视,对此病的研究也正在逐渐深入,特别是免疫学及其疫苗的研究正日益受到关注。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研究进展和使用现状做了系统地阐述,特别是通过合理地选择和使用免疫佐剂,如γ干扰素、霍乱毒素及可溶性β葡聚糖等来改进疫苗作用方面进行了阐述。     

CD163与猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展

猪繁殖与呼吸综合征,又称猪蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染、引发的猪的一种流行性传染病。PRRSV病毒通过感染机体的巨噬细胞或单核细胞,进一步引发怀孕母猪妊娠后期流产或胎儿死亡。同时,该病毒感染仔猪后,可引发机体较为严重的呼吸系统相关疾病。目前研究发现,PRRSV在感染过程中,需要与CD163蛋白分子结合,从而介导其自身的膜结构与宿主细胞膜进一步融合,从而感染宿主细胞。本文系统地介绍了PRRSV的基因组结构、感染途径以及与CD163蛋白的相关性,以期为进一步研发相关抗体及生产蓝耳病抗性的猪种奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征的研究

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的高度传染性病毒病。笔者就PRRS病毒的生物学特征、理化特性、基因组结构蛋白、免疫学特征以及疫苗等方面作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

PRRSV GP5蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组牛痘病毒,本研究通过RT-PCR获得PRRSV CH-1a株GP5蛋白基因,将其克隆至pMD18-T栽体.经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至转移质粒pSC11中,构建重组转移质粒(pSC11-GP5).将pSC11-GP5转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞.与牛痘病毒进行同源重组.在舍有X-gal的琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得了含有PRRSV GP5基因的重组病毒(rWR-PRRSV-GP5).IFA及动物试验表明,重组病毒表达了PRRSV GP5蛋白,并在免疫小鼠体内诱生了较强的PRRSV抗体.实验表明,该重组病毒所表达的PRRSV GP5蛋白保持了良好的抗原性,为进一步研究PRRSVGP5蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础.     

PRRSV基因缺失片段dNsp2(87)的原核表达

将质粒pUC57-dNsp2(87)经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,与经过相同酶切处理的pET-32a相连接,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot检测,dNsp2(87)重组菌得到了有效表达,融合蛋白的分子质量约为23.5 ku,表达量可达菌体总蛋白的28.9%,重组蛋白能被PRRSV普通株阳性血清所识别,具有一定的生物学活性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位研究进展

根据病毒表位与受体细胞结合部位的差异可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原表位的研究已有大量报道,论文根据PRRSV的基因组结构蛋白和非结构蛋白基因编码区特点,对鉴定的PRRSV相关抗原表位进行简要综述,为进一步开发PRRSV快速鉴别诊断方法和多表位疫苗奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传技术的研究进展

反向遗传操作技术可以在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而可以对病毒基因组的表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究。本文就反向遗传操作技术在PRRSV基因功能结构研究以及新型疫苗开发等研究中的应用进行了综述。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(JX0601)NSP2基因主要抗原区域的原核表达与纯化

本研究采用PCR方法从高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（JX0601）质粒扩增得到NSP2基因的主要抗原决定区域dNSP2,克隆目的基因连接到pGEM—TEasy,再将其亚克隆到pET-32a上,构建表达载体pET—dNSP2,然后转化大肠埃希菌BL-21（DE3）,分别用不同浓度的IPTG诱导表达,经SDS—PAGE电泳分析,所表达融合蛋白的分子质量约为38．3ku,用His Bind Purification Kit试剂盒纯化蛋白,Western blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。本试验为进一步研究PRRSV诊断试剂盒奠定了基础。     

PRRSV广西分离株GXYL-1403全基因克隆与序列分析

对本实验室所分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株GXYL-1403进行全基因组克隆和序列分析。参考已发表的扩增全长PRRSV序列的13对特异性引物,用RT-PCR方法对病毒基因组进行分段扩增。将扩增得到的PCR片段克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。通过软件对所扩增序列进行拼接,获得GXYL-1403的全长序列,并对GXYL-1403进行比较和遗传进化分析。结果表明GXYL1403株基因序列全长为15 018bp,与国内外多株PRRSV毒株进行同源性比较发现,与VR-2332的相似性为89.1%,与TJ、JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性达到了97.9%~98.1%。另外,GXYL-1403分离株nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别重要的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游出现了连续74个氨基酸的缺失。遗传进化分析发现美洲型PRRSV主要分为3个亚群,GXYL-1403跟高致病性PRRSV毒株属于同一分支,证实了GXYL-1403株为美洲型PRRSV毒株。     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。     

近几年我国PRRSV进化趋势及其对防控策略的影响

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称猪"蓝耳病",是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以种猪群繁殖障碍,仔猪、生长育肥猪群呼吸道问题为特点,严重危害养猪业的重要病毒性疾病,给全世界养猪业造成了巨大的经济损失.自从2006年暴发高致病性PRRSV以来,PRRSV在国内不断变异演化,田间流行的毒株经常发生重组或变异...