罗曼粉蛋鸡感染E亚型禽白血病病毒的分子生物学检测分析

为排查贵州省惠水县某养鸡场禽白血病病毒的感染情况,对鸡场送检的10只病死罗曼粉蛋鸡进行禽白血病病毒PCR检测和遗传进化分析。结果：10份病料样品中6份检测出禽白血病病毒;基因序列分析与E亚型禽白血病病毒E-ros001、E-B9、E-TYR株同源性高达99.1%,与J亚型GZN16株同源性最低为37.1%;系统进化树分析表明与E亚型毒株亲缘关系最近。结论：该养鸡场存在E亚型禽白血病病毒感染。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

2011年~2012年四川地区J亚型禽白血病分子流行病学调查

为了解2011年~2012年四川地区J亚型禽白血病病毒(ALV-J)流行情况及流行病毒株的分子特征,本研究采集四川地区疑似禽白血病的病料样品784份(血液样品700份,组织样品84份)进行PCR检测,并对部分样品的gp85基因进行序列测定和分析。血液样品和组织样品ALV-J检出率分别为3.1%(22/700)和14.3%(12/84)。核苷酸序列比对结果表明,18个阳性样品的gp85基因核苷酸同源性为87.7%~99.8%,与ALV-J株HPRS-103的核苷酸同源性为87.3%~98.2%,与以前分离的J亚群四川株SCGS-1的核苷酸序列同源性为87.9%~94.4%。遗传进化分析表明,18个样品分别属于不同的分支,其中来自石棉的样品SM与其他样品的遗传距离最远。该调查结果显示四川地区鸡场的ALV-J感染比较普遍,其gp85基因存在明显的遗传多样性,引种是导致这种遗传多样性的重要原因。     

江苏地区猪流行性腹泻流行病学调查及病原S基因序列分析

为探究江苏省内猪场猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行和遗传变异情况,采集江苏省13个地级市规模猪场和屠宰场健康猪群的鼻拭子和肛拭子样品,通过RT-PCR方法检测PEDV,并对部分阳性样品进行S基因序列扩增、测序及遗传进化分析。结果显示：259份猪鼻拭子样品中,PEDV阳性检出率为10.42%(27/259);178份猪肛拭子样品中,PEDV阳性检出率为9.55%(17/178)。选取的8株PEDV代表株的核苷酸序列同源性在99.2%～100%之间,氨基酸序列同源性在95.2%～97.1%之间,与国内流行毒株SD-M、JS2008的同源性最高,核苷酸序列同源性达到97%以上;遗传进化分析显示,8株PEDV代表株属于同一群,与经典毒株CV777、DR13亲缘关系较近。本研究初步明确了江苏地区健康猪群中猪流行性腹泻流行状况和PEDV遗传演化特点,为有效防控猪流行性腹泻提供参考。     

哈尔滨地区猫白血病病毒流行情况及遗传变异分析

为了了解哈尔滨地区猫白血病的发病情况及猫白血病病毒的遗传变异情况,试验收集了哈尔滨地区51份猫的血液样本,用PCR方法扩增该病毒保守区域pol基因,并对阳性样本进行同源性分析与遗传进化分析。结果表明：25份样本检测结果为阳性,阳性率为49%。其中,公猫样本17份,母猫样本8份;<2岁猫样本有20份,2～4岁猫样本有3份,>10岁猫样本有2份,体重<3 kg猫样本有6份,3～6 kg猫样本有15份,>5 kg猫样本有4份。25份样本的核苷酸序列与参考序列的核苷酸相似性为89.2%～100%。遗传进化分析显示它们来自同一个分支,遗传关系较近,可能与地理分布有关。说明哈尔滨地区的猫白血病的发病率较高并且病毒基因型高度相似。     

云南省新城疫病毒分离株F基因和HN基因克隆与序列分析

为了确定云南NDV毒株F基因和HN基因的结构特征及其与已知毒株的遗传相关性,应用RT-PCR技术对云南省部分地州养殖场采集的鸡或鸭喉气管组织样品4 700份进行新城疫病毒(NDV)检测,共检出阳性样品25份。对其中8份阳性样品进行NDV F基因与HN基因扩增后,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外代表性毒株和当前流行疫苗毒株进行比对及系统发育分析。结果表明,云南省NDV毒株F基因与国内代表性毒株核苷酸序列同源性介于93.0%～99.2%之间,氨基酸同源性介于90.7%～99.1%之间;与疫苗毒株的核苷酸同源性在83.3%～86.9%之间,氨基酸同源性在86.0%～88.7%之间。HN基因与国内代表性毒株核苷酸同源性介于96.4%～99.1%之间,氨基酸同源性介于95.6%～99.3%之间;而与当前疫苗毒株相比,同源性较低,核苷酸同源性介于81.3%～82.0%之间,氨基酸同源性介于87.6%～88.8%之间。系统进化分析表明,云南NDV F基因有2株属于基因Ⅱ型,其余6株均属于基因Ⅶe型。云南NDV HN基因则均属于基因Ⅶ型。     

2020-2021年河南省猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化及S蛋白变异分析

2020-2021年在河南省18个地区共收集499份发生腹泻的仔猪临床样品,采用RT-PCR进行猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)筛查。结果显示,共检测出162份阳性样品,阳性率为35.2%。对其中21株PEDV流行毒株S基因进行了测序、同源性比对和遗传进化分析,结果显示21株PEDV流行毒株之间核苷酸同源性为96.9%～100%,氨基酸同源性为95.2%～100%。与52株2011-2019年国内流行毒株之间的核苷酸同源性为95.1%～99.5%,氨基酸同源性为91%～99.8%。遗传进化结果显示,21株PEDV毒株均属于GⅡb群。氨基酸序列比对显示,流行毒株S蛋白存在7处新的且规律的氨基酸突变。本试验对现阶段我国所流行的PEDV S基因进行测序分析,为了解PEDV流行毒株遗传变异趋势和研发新的有效疫苗提供参考。     

河北北部猪圆环病毒2型流行毒株的遗传变异分析

为了掌握河北北部地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法对2015—2017年间收集的河北北部猪场86份临床病料进行PCV2检测,并对阳性毒株的全基因进行扩增、克隆和测序。结果显示,86份临床样品中,有38份样品为PCV2阳性,阳性率为44.19%,选取11株进行病毒全基因扩增,并利用序列比对软件进行遗传变异分析发现,11株病毒之间同源性为95.9%～99.9%,与各参考毒株之间同源性为93.5%～99.9%。在遗传进化关系上,11株病毒分别处于2个分支:PCV2b和PCV2d,表明河北北部地区PCV2流行比较广泛,并且以PCV2b和PCV2d毒株流行为主。本研究充实了河北北部地区PCV2流行病学调查资料,也为河北PCV2疫苗株的研发和选择提供了依据。     

华中地区犬细小病毒流行病学调查及其VP2基因序列分析

为了解华中地区犬细小病毒2型(CPV-2)的流行趋势以及变异情况，本研究于2020年9月至2022年1月间采集华中地区的418份疑似感染犬细小病毒的粪便样品，通过PCR方法检测，利用F81细胞进行病毒分离、间接免疫荧光试验，并对分离病毒的VP2基因进行氨基酸序列及其同源性和遗传进化分析。结果显示，358份病料检测出CPV-2,阳性率为85.65%。病料接种F81细胞后，有23份阳性样品出现明显细胞病变，间接免疫荧光试验观察到明显荧光。VP2基因序列分析结果表明，分离毒株中有New-CPV-2a型12株、New-CPV-2b型5株、CPV-2c型6株。核苷酸同源性为97.9%～99.8%,氨基酸同源性为95.9%～100.0%。遗传进化分析结果显示，分离毒株与国内分离株、伊朗、巴西分离株亲缘关系较近，与意大利、日本、阿根廷分离株亲缘关系较远。本研究为华中地区犬细小病毒防控及研制高效疫苗奠定了基础。     

临床健康宠物猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列分析

为了解猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)在健康猫群中的流行情况,分析病毒衣壳蛋白基因的遗传变异特性,本试验采用荧光定量PCR方法检测了8份采集自吉林省临床健康宠物猫的口腔棉拭子,利用F81细胞对检测呈阳性的样品进行病毒分离培养,通过电镜观察、PCR方法对所分离的病毒进行鉴定。结果分离到1株病毒,鉴定为猫杯状病毒,测定其ORF2基因序列全长为2 007 nt,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为68.8%~78.4%。遗传进化分析表明,来自中国的3个分离株处于同一分支,亲缘关系较近。     

一株输入性猫传染性腹膜炎病毒的分离鉴定和遗传特征分析

从北京地区临床疑似传染性腹膜炎患猫的粪便和腹水样品中分离猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus, FIPV),共采集10份样品进行RT-PCR检测,并接种MDCK细胞进行病毒分离和鉴定。结果表明：10份样品的RT-PCR检测结果均为FIPV阳性,将样品接种MDCK细胞并经连续传代培养,成功分离到一株FIPV,经鉴定属于FCoV-Ⅱ血清型,将其命名为FIPV/BJ01株;该毒株可以在MDCK细胞上增殖并产生典型的细胞病变,病毒滴度为105.5TCID50/0.1mL;S和N基因的核苷酸与其他毒株的同源性分别为63.3%~99.4%和45.5%~992%,均与美国毒株同源性较高,而与中国毒株的同源性较低。     

猪瘟病毒云南流行毒株E2基因遗传变异分析

为了解云南省猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)流行毒株E2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR检测云南省疑似猪瘟阳性样品,并获取4株E2全基因序列。对所获的E2基因序列与国内外参考毒株进行同源性和遗传进化树比对分析。结果表明,获得4条全长均为1119bp的云南省CSFV流行毒株E2全基因序列。4株云南毒株序列的同源性为81.7%～99.6%,与疫苗毒株的同源性为81.3%～94.5%,与其他参考序列的同源性为81.8%～99.6%。遗传进化分析表明,4株云南流行毒株分为两个不同的进化分支,1株流行毒株和疫苗毒株同属于1.1基因亚型,其他3株流行毒株分布在另一进化分支上,属于2.1c基因亚型,研究结果为云南地区猪瘟的防控提供了一定的理论参考。     

云南省部分猪场病料猪圆环病毒3型PCR检测及克隆测序

为了解猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)在云南省的流行及遗传进化情况,2020年10—12月收集云南省部分猪场疑似病料共24份,采用PCR方法进行PCV3病原检测;选取PCV3阳性扩增产物进行克隆测序,并将测序结果与16株国内外参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果显示:24份病料样品中检出阳性5份,阳性检出率为20.8%;克隆出的阳性扩增产物(YNJS-2020)ORF2核苷酸序列和国内外参考毒株的同源性较高,为97.4%～98.9%,其中与西班牙毒株MF80572000同源性最高,与安徽14-201611毒株同源性最低。结果表明,云南省存在PCV3流行,且流行毒株与国内外其他毒株遗传关系较近,但也有一定差异。结果提示,云南省应加强对PCV3的监测及其流行的控制,避免PCV3大面积流行。本研究为云南省PCV3基因型分析和疫苗研究提供了一定的数据基础。     

广东鹅源圆环病毒分子流行病学调查与毒株遗传进化分析

为了解广东地区圆环病毒在鹅群中的流行情况。研究针对鹅圆环病毒全基因组保守序列设计特异性检测引物,采用PCR方法对送检的232份鹅疑似鹅圆环病毒感染病例进行检测。并针对其中一份阳性样品病毒全基因组进行测序,获得该毒株全基因组序列信息。对该毒株全基因进行遗传进化分析、Cap蛋白相似性分析和B细胞抗原表位预测。结果显示,232份样品中阳性检出率为44.4%,表明鹅圆环病毒在广东地区鹅群中普遍存在,鹅圆环病毒毒株与其他已报道的鹅源毒株处于同一遗传进化分支,鹅源毒株间Cap蛋白相似性为98.0%~100%,但与鸭圆环病毒相似性低(46.9%~48.2%);Cap蛋白B细胞线性表位预测结果提示,鹅源和鸭源毒株表位位置相近,但氨基酸序列差异较大,提示两种毒株之间交叉保护力可能存在差异。研究为了解广东地区鹅源圆环病毒流行、进化情况,并进一步做好相关防控工作提供理论参考。     

2010～2011年中国部分地区禽坦布苏病毒感染调查及分子变异分析

为了解中国目前禽坦布苏病毒在家禽中的流行状况及病毒分子演化特征,对2010～2011年采集自中国沿海及周边的9个省的439份疑似家禽坦布苏病毒感染的临床样品进行了鉴定,并进行了分离毒株NS5基因的分子遗传进化分析。结果表明,2010年采集的187份家禽病料中检测出42份阳性样品,阳性率为21.6%,而2011年采集的252份样品中检测出37份阳性样品,阳性率为13.9%。对部分毒株的NS5基因测序表明,本研究分离的禽坦布苏病毒与已发布的同时期分离的禽坦布苏病毒NS5基因同源性在98%以上,与2010年前分离的鸡源及蚊媒坦布苏病毒的同源性介于83.8%～85.8%之间;所有2010年后分离的禽坦布苏病毒毒株在系统进化上共同构成了一个进化分支。结果表明,2011年禽坦布苏病毒仍在中国沿海及周边的9个省的家禽中流行,病毒NS5基因的测序分析表明,到目前为止在家禽中流行的禽坦布苏病毒未出现明显的分子变异。     

2019年我国部分地区鸭圆环病毒基因序列测定与分析研究

为了解近年鸭圆环病毒流行毒株的基因遗传特点和变异情况,通过采用PCR的方法对我国部分地区的30份鸭圆环病毒阳性样品进行全基因组扩增与克隆、序列测定及遗传进化分析。结果显示:30株DuCV流行毒株之间的全基因序列同源性为85.8%~99.9%,其中26株DuCV的全基因序列长为1993~1995 bp,与德国代表株处于同一进化分支,属于基因1型,4株DuCV的全基因序列仅有1988 bp,与中国台湾代表株属于同一进化分支,属于基因2型;Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的变异分析表明Cap蛋白的变异程度要显著高于Rep蛋白。     

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株的分子流行病学调查及防控策略

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2015年1-8月份采自广西省各规模猪场的疑似样品进行PRRSV检测,并对阳性病料进行基因测序分析。结果显示:84份疑似样品中有40份检测为阳性,阳性率为47.6%,通过完整的ORF5基因序列遗传进化分析表明,广西地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且均与高致病性PRRSV高度同源。广西省各规模猪场毒株与2015年7月份采自广东肇庆某规模猪场的PRRSV分离毒株间的同源性均较低,经序列对比发现,广东肇庆分离毒株与美洲流行毒株NADC 30高度同源。结果表明,广西地区主要流行毒株为美洲型高致病性PRRSV毒株,且与美洲流行毒株NADC30同源性较低,但广东地区已出现美洲流行毒株NADC30,提示广西地区需加强对PRRSV流行及变异的监测,以及采取有效防控策略的必要性。     

北疆地区猪圆环病毒3型PCR检测及分析

为了解北疆地区猪群PCV3的流行情况,试验采集40份不同日龄猪血样,采用巢式PCR方法进行检测分析,并对其中阳性样本进行克隆测序验证。结果检测出PCV3总阳性数为20份,平均总阳性率为50%(20/40),各日龄阶段皆有阳性检出。同源性分析表明,各株PCV3序列同源性为97.90%～99.70%;遗传进化分析表明,试验得到的其中2株基因序列属于3a亚群。试验结果发现PCV3毒株之间相似性很高,为北疆甚至新疆地区PCV3的防控奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒流行株S全基因的遗传进化与重组分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究对2016—2018年间从河南和山西等地多个规模化猪场随机采集的25份患有腹泻仔猪小肠及内容物提取RNA进行PEDV RT-PCR检测,阳性样品进行S全基因克隆、遗传进化与重组分析。结果显示,25份腹泻仔猪样品中检测出18个PEDV阳性样品,成功克隆18株PEDV毒株S全基因序列,与GenBank中发表的30条PEDV S基因序列进行比较分析,核苷酸同源性均在92.8%以上,存在多处碱基点突变、插入与缺失,且SX-TY1-2017毒株在3 291～4 132 nt位置处发生重组,可能是由亲本株CH/HNZZ47/2016和HN-KF-2017重组产生的。基于S全基因遗传进化树结果,克隆的18株PEDV属于G2群且位于不同分支,表明PEDV流行株在2016—2018年间出现一定的变异。     

2015-2016年北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

为了解北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2015-2016年省内各地163家养殖场的874份PRRS疑似病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品的ORF5基因进行测序及变异分析.结果显示,PRRSV阳性样品共209份,阳性率为23.9%.扩增阳性样品的ORF5基因序列,并选取44条有代表性的基因序列,遗传进化分析表明,北方某省PRRSV流行毒株为美洲型毒株,其ORF5基因核苷酸同源性为82.6%~99.5%,与VR-2332、CH-1a、HuN4和JXA1、CHsx1401和NADC30株的核苷酸同源性分别为83.5%~99.3%、85.1%~95.2%、83.5%~99.3%和82.4%~96.8%.基于ORF5基因核苷酸序列绘制的遗传进化树显示,目前北方某省流行的美洲型PRRSV可分为4个亚群,其中24株属于以CHsx1401和NADC30为代表的Ⅱ亚群,19株属于以HuN4和JXA1为代表的Ⅳ亚群,1株属于以VR2332为代表的Ⅰ亚群.各毒株ORF5基因序列之间存在一定差异,但无明显地域性.本研究结果可为北方某省PRRSV遗传进化研究和疫病防控提供参考.