DNA—RNA杂交法检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ，制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物、ＰＣＲ产物重组子和新城疫强弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ、ＩＬＴ、ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料和杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是敏感且特异的检测方法。     

用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物重组子和新城疫强，弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ，ＩＬＴ，ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是且特异的检测方法。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD—PCR扩增产物及它们基因 …

Ｋ７００ｂｐ是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－３’），通过ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增出来的一个特有ＤＮＡ片段。然后将Ｋ７００ｂｐ制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ片段。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD-PCR扩增产物及它们基因组DNA分子杂交的研究

Ｋ７００ｂｐ 是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－ ３’） ，通过ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ 扩增出来的一个特有ＤＮＡ 片段。然后将Ｋ７００ｂｐ 制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ 确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ 片段。     

DIG—标记鸡传染性法氏囊病病毒cDNA探针的制备

用ＩＢＤＶ特异引物对ＩＢＤＶ ＲＮＡ进行逆转录和ＰＣＲ扩增。以低融点琼脂糖凝胶电泳法回收ＰＣＲ扩增带，经酚－氯仿纯化后，用ＤＩＧ标记制备ＩＢＤＶ ｃＤＮＡ核酸探针。斑点杂交试验证明，该探针能与ＩＢＤＶ不同毒株发生阳性杂交反应，敏感度为１ｐｇ。本实验制备的ＩＢＤＶ ｃＤＮＡ核酸探针不仅为ＩＢＤＶ的流行病学研究和分子生物学鉴定提供了敏感可靠的手段，而且也是核酸探针制备方法的一次探索。     

DIG－标记鸡传染性法氏囊病病毒cDNA探针的制备

用ＩＢＤＶ特异引物对ＩＢＤＶＲＮＡ进行逆转录和ＰＣＲ扩增。以低触点琼脂糖凝胶电泳法回收ＰＣＲ扩增带，经酚－氯仿纯化后，用ＤＩＧ际记制备ＩＢＤＶＣＤＮＡ核酸探针．斑点杂交试验证明，该探针能与ＩＢＤＶ不同毒株（ＳＴＣ、Ｌｕｋｅｒｔ、Ｂ＿２和ＬＱ）发生阳性杂交反应，敏感度为１ｐｇ．本实验制备的ＩＢＤＶｃＤＮＡ核酸探针不仅为ＩＢＤＶ的流行病学研究和分子生物学鉴定提供了敏感可靠的手段，而且也是核酸探针制备方法的一次探索。     

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气 …

将ＩＢＶＴ株基因组Ｓ１基因上０．６kb片段（位于Ｓ１基因上１１２１bp～１７２３bp之间）克隆到ＰＩＢ－ＰＣＲ Ｃloning vector中,用地高辛标记探针,分别与９株ＩＢＶ 的ＰＣＲ产物和１２株ＩＢＶ的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ,ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测ＩＢＶ－ＰＣＲ产物的灵敏度为１００～２００pg。用该探针检测不同毒株ＩＢＶ在鸡胚中的繁     

应用复合引物扩增大肠杆菌肠毒素基因的研究

以两对合成的不同寡核苷酸引物通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、扩增肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）不耐热肠毒素（ＬＴ）和耐热肠毒素（ＳＴ）基因；两对引物从ＥＴＥＣＬＴ和ＳＴ基因中分别扩增出３１４ｂｐ，２３７ｂｐ的ＤＮＡ片段，均能与相应的ＬＴ和ＳＴ基因探针杂交。ＬＴ扩增产物（３１４ｂｐ）和ＳＴ扩增产物（２３７ｂｐ）分别和ＳｍａⅠ和ＨｉｎｃⅡ酶切后，产生１９０ｂｐ和１２４ｂｐ，１４７ｂｐ和９０ｂｐ的ＤＮＡ片段。同一扩增反应中应用ＬＴ和ＳＴ复合引物进行扩增，３种基因型ＬＴ、ＳＴ和ＬＴＳＴＥＴＥＣ从样品中鉴定出。１０９份动物腹泻粪样分别用ＰＣＲ，核酸杂交和ＥＬＩＳＡ进行测定，结果表明，ＰＣＲ是最为灵敏和快速的测定ＥＴＥＣ的方法。     

限制性内切酶片段长度多态性有几个绵羊品种中的研究

本文利用羊的促卵泡激素（ＦＳＨ）ｃＤＮＡ，胸腺基因组ＤＮＡ及卵泡抑止素ｃＤＮＡ等３种探针与泰国长尾羊，咯麦隆羊及它们Ｆ１代杂种的基因组ＤＮＡ进行分子杂交，结果在ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ和ＴａｑⅠ酶切的ＤＮＡ片段与ＦＳＨ ｃＤＮＡ杂交的图谱上，可观察到ＲＦＬＰ的存在，并可根据某些特殊区带的存在与否区别两个不同种的羊。用ＥｃｏＲⅠ酶切的ＤＮＡ片段与胸腺基因组ＤＮＡ探针杂交，也发现了ＲＦＬＰ，而其它３种酶     

马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆…

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

限制性内切酶片段长度多态性在几个绵羊品种中的研究

本文利用羊的促卵泡激素（ＦＳＨ）ｃＤＮＡ，胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）基因组ＤＮＡ及卵泡抑止素（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ等３种探针与泰国长尾羊，喀麦隆羊（Ｃａｍｅｒｏｏｎ）及它们Ｆ１代杂种的基因组ＤＮＡ进行分子杂交，结果在ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ和ＴａｑⅠ酶切的ＤＮＡ片段与ＦＳＨｃＤＮＡ杂交的图谱上，可观察到ＲＦＬＰ的存在，并可根据某些特殊区带的存在与否区别两个不同种的羊。用ＥｃｏＲＩ酶切的ＤＮＡ片段与胸腺基因组ＤＮＡ探针杂交，也发现了ＲＦＬＰ，而其它３种酶的酶切片段与此探针杂交，个体间的图谱是一致的。利用本实验所采用的４种限制性内切酶，在所测定品种及杂交种的卵泡抑止素位点没有发现变异。     

2型犬腺病毒DNA不同酶酶切片段E3区定位研究

从２型犬腺病毒的ＭＤＣＫ细胞培养物中提取线状双链病毒基因组ＤＮＡ，利用限制性内切酶ＰｓｔＩ、ＢｇｌⅠ和ＨｉｎｄⅢ分别进行酶切，在１％琼脂糖凝胶上电泳，随后Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹到尼龙膜上，利用Ｄｉｇｏｘｉｎ标记的２型犬腺病毒Ｅ３区ＰＣＲ产物与膜上ＤＮＡ杂交，结果发现，Ｅ３区探针分别与病毒ＤＮＡ的ＰｓｔＩＢ片段、ＢｇｌＩＡｌ片段和ＨｉｎｄⅢＡ２、Ｂ２片段呈现阳性杂交反应，该结果为Ｅ３区的克隆及犬腺病毒     

应用生物素标记的NDV—cDNA探针检测感染尿囊液中DNV—RNA的初…

本文应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从构建的新城疫病毒（ＤＮＶ）ｃＤＮＡ文库中扩增含编码Ｆ糖蛋白前体－Ｆｏ酶切位点序列的３５９ｂｐ的Ｆ蛋白基因ｃＤＮＡ片段。将此３５９ｂｐ ｃＤＮＡ片段经光敏生物素标记后，即成ＤＮＶ－ｃＤＮＡ探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出ＤＮＶ强毒株和疫苗毒株的基因组ＲＮＡ，而不与ＩＢＤＶ－ｄｓＲＮＡ，ＡＩＢＶ－ｓｓＲＮＡ，ＥＤＳ７６－ｄｓＤＮＡ、ＭＤＶ０ｄｓＤＮＡ、Ｆ     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT—PCR扩增及其 …

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶ Ｓ１全基因特异性引物分别从我国华东,华北,华中,华南,西北及东北等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅⅢ酶切分析及其与英国ＩＢＶ Ｓ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶ Ｓ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５‘和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切识别位点的分子修饰之后插入到     

地高辛标记DNA探针检测伪狂犬病的研究

利用伪狂犬病病毒特异性扩增产物制成地高辛标记的探针，对闽Ａ株，鄂Ａ株，Ｂａｒｔｎａ株，英国株及临床病料进行检测，其结果与ＰＣＲ检测结果相符，准确率为１００％，灵敏度达到２ｐｇＤＮＡ，试验认为该探针具有灵敏、特异、安全的特点     

地高辛标记DNA探针检测伪狂犬病的研究

利用伪狂犬病病毒特异性扩增产物制地高辛标记的探针，对闽Ａ株，鄂Ａ株，Ｂａｒｔｎａ株，英国株及临床病料进行检测，其结果与ＰＣＲ检测结果相符，准确率为１００％，灵敏度达到２ｐｇＤＮＡ，试验认为该探针具有灵敏，特异，安全的特点。     

牛β—酪蛋白基因上游调控序列PCR扩增及克隆

采用蛋白酶Ｋ法从母牛肝中提取染色体ＤＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板。以引物设计软件从牛β－酪蛋白基因上游６００ｂｐ至第１个外显子设计引物,引物长度１９ｎｔ,跨度６３７ｂｐ。扩增产物电泳结果显示,在分子量Ｍａｒｋｅｒ６５７ｂｐ带附近,出现一明显亮带,这一结果与设计产物大小基本一致。用低温冷冻法纯化ＰＣＲ产物,煮沸裂解法提取载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫｓ＋质粒,ＥｃｏＲＶ酶切质粒ＤＮＡ,Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接ＰＣＲ扩增片段和质粒ＤＮＡ。将重组质粒ＤＮＡ转化到ＪＭ１０１大肠杆菌中,经筛选、酶切、测序鉴定,结果表明所克隆的片段为牛β－酪蛋白基因上游调控序列。     

PCR技术在兽医卫生检验中的应用

ＰＣＲ技术，即聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｃａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是８０年代中期发展起来的一项体外基因扩增技术。该技术问世以来，已在医学工程、疾病诊断、遗传工程、考古学及法医学等领域得到广泛应用。我所于１９９６年引入该技术，检测样品２４５份，提高了兽医卫生监督检验的科技含量，满足了检疫、科研、生产的需要。本文依据操作体会，对ＰＣＲ技术的原理、特点及应用作一综述。１ＰＣＲ技术原理 ＰＣＲ技术的原理是双链ＤＮＡ通过热变性，解链成两条单链，此两条单链均可作为ＤＮＡ合成的模板。寡核苷…     

吉氏巴贝斯虫cDNA探针的制备及杂交试验

本实验将－６．６ｋｂ的吉氏巴贝斯虫ｃＤＮＡ片段以光照活化法标记光敏生物素，制备成光敏生物素探针。与吉氏巴贝斯虫基因组ＤＮＡ、伊氏锥虫基因组ＤＮＡ、犬白细胞ＤＮＡ的斑点杂交试验表明，该探针可与０．００１ｎｇ以上量的吉氏巴贝斯虫ＤＮＡ杂交，而不与任何浓度的伊氏锥虫ＤＮＡ和犬ＤＮＡ杂交，具有很高的敏感性和特异性。