狂犬病快速诊断方法的建立和应用

根据狂犬病病毒核蛋白基因保守区序列设计1对引物，建立了用于狂犬病病毒特异性核酸检测的RT-PCR技术。该技术可从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及鼠脑组织中．扩增出443bp的核酸片段，检出核酸的敏感性约为3pg。对30份不同种动物脑组织的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合，但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断，具有快速、简便和敏感的优点。     

贵州部分地区犬狂犬病疫苗免疫和病毒携带情况调查

为了解贵州地区宠物犬、流浪犬和农村散养犬的狂犬病疫苗免疫状况和病毒携带情况,在贵州部分地区采集245份犬血清样本、320份犬唾液样本进行狂犬病血清抗体和病毒抗原及核酸检测。结果表明：在245份犬血清样本中有149份为狂犬病抗体阳性,阳性率为60．82％,其中城市宠物犬、流浪犬和农村散养犬分别为76．40％、40．48％和56．14％;在320份犬唾液样本中有31份为狂犬病病毒抗原阳性,阳性率为9．69％,其中城市宠物犬、流浪犬和农村散养犬分别为6．71％、9．05％和10．53％,但 RT-PCR 检测均为狂犬病病毒核酸阴性。说明,贵州部分地区犬狂犬病疫苗免疫强度不高,且有部分狂犬病病毒抗原阳性犬,应加强犬只的管理与免疫。     

牛伪狂犬病研究进展及免疫前景分析

阐述了牛伪狂犬病流行病学现状、病毒分子生物学研究状况、疾病诊断和免疫学成果,并对免疫学发展前景进行了分析。     

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

免疫组织化学方法诊断猪圆环病毒病

以猪圆环病毒Ⅱ型ORF2(PCV2-ORF2)重组蛋白为抗原,按常规免疫方法免疫家兔,制备兔抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白的IgG,以此IgG为第一抗体,采用免疫组织化学二步法,对临床疑似猪圆环病毒病例及RT-PCR确诊为阳性猪圆环病毒病例的肺脏组织切片进行检测。试验结果证明,该免疫组织化学方法具有良好的特异性、直观性,简单易行,可以对猪肺巨噬细胞中的存在的PCV2病毒抗原进行准确的定性和定位诊断。     

狂犬病免疫制剂的研究

狂犬病免疫制剂的研究湖北省黄冈地区农牧局郭芳彬狂犬病是由狂犬病毒引起的，主要侵害中枢神经系统，以狂躁、恐水为临床特征的一种急性直接接触传染性人兽共患病。该病遍布世界各地，严重威胁人类健康。据联合国世界卫生组织（ＷＨＯ）估计，全世界每年约有５万人死于狂...     

猪伪狂犬病病毒双重 PCR 鉴别方法的建立

根据Gen Bank已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的g B、g E基因序列,分别设计了2对特异性引物,建立了一种鉴别诊断猪伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的双重PCR检测方法。应用该方法可从野毒基因组中扩增出与预期大小相符的2条特异性条带,分别为122 bp(g E)和246 bp(g B);从疫苗株基因组中仅扩增出1条特异性条带,为246 bp(g B)。结果显示,该方法灵敏度高、特异性强,适用于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)g I/g E基因序列,设计一对特异性引物,建立了鉴别PRV野毒感染的荧光定量PCR方法。该方法灵敏度达到102拷贝/μL,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙脑病毒(JEV)不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;用PRV强毒攻毒仔猪,荧光定量PCR比普通PCR能更灵敏检出组织带毒量。该方法可以用于猪的组织样品,如脑、肺、扁桃体、淋巴结等样品中伪狂犬野毒的定量,可用于临床伪狂犬野毒感染的早期检测和定量分析猪伪狂犬病毒感染程度。     

猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)g I/g E基因序列,设计一对特异性引物,建立了鉴别PRV野毒感染的荧光定量PCR方法。该方法灵敏度达到102拷贝/μL,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙脑病毒(JEV)不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;用PRV强毒攻毒仔猪,荧光定量PCR比普通PCR能更灵敏检出组织带毒量。该方法可以用于猪的组织样品,如脑、肺、扁桃体、淋巴结等样品中伪狂犬野毒的定量,可用于临床伪狂犬野毒感染的早期检测和定量分析猪伪狂犬病毒感染程度。     

禽流感病毒 HA 基因在狂犬病毒中的表达

为了研究狂犬病毒作为载体表达外源基因的特性,将禽流感病毒 HA 基因插入狂犬病毒全基因组cDNA感染性克隆pHEP-3.0 G基因与L基因的假基因位点,再通过反向遗传技术,获得了携带流感病毒 HA 基因的嵌合狂犬病毒(HepFHA),并进行了病毒传代与 HA 基因表达的研究. 结果显示,重组病毒经BHK-21细胞传代10次,病毒表达稳定,但各代次常规红细胞凝集试验均为阴性; Western blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达,其相对分子质量为39 540,与HA裂解的HA1蛋白相对分子质量相吻合.     

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒(CVS、3aG株)及2株街毒(Sx、PB3)的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列.DNAstar软件分析表明:2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100％,2株固定毒株同源性为84.2％,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9％和73.7％;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4％ ～ 84.2％,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100％.对糖蛋白信号肽疏水区(-15位到-4位)的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒.     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及纯化

采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因,并将目的基因亚克隆入原表达载体pET-28 a(+)中,经PCR、双酶切以及序列分析,结果表明:已成功构建了重组质粒.将重组质粒转化至大肠埃希氏菌Rossetta(DE3),在37℃,1 mmol/L IPTG条件下进行诱导表达.诱导产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为54 KD附近出现较粗的目的带,与预期的目的蛋白分子量相符合.经表达条件优化,用1 mmol/LIPTG在37℃诱导表达5 h,表达量达到最高,Western-Blotting鉴定目的蛋白有较强的免疫原性.为狂犬病毒的N蛋白的新型疫苗的制备奠定了基础.     

狂犬病病毒HEP-Flury株N基因的修饰及原核表达

为了高效表达狂犬病病毒HEP-Flury的核蛋白,选取抗原决定簇富集区,利用生物信息学技术分析了狂犬病病毒HEP-Flury N蛋白的核苷酸序列.根据大肠埃希菌Escherichia coli对密码子的偏嗜性,首先对所选取的核苷酸序列进行修饰、引入酶切位点,然后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-NP.将其转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS,以IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量34 000处有1条特异的蛋白带,与预期大小一致.Western-blotting检测结果显示,该蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异识别,表明所表达的N蛋白具有良好的免疫原性.     

实验感染肉鸡组织中J亚群禽白血病病毒的抗原定位

从实验感染J亚群禽白血病病毒(ALVJ)的髓细胞性白血病肉鸡病例中,选取典型病例,用J亚群禽白血病病毒单克隆抗体通过免疫酶组化试验对不同组织进行了抗原定位观察。结果显示:在实验感染阳性肉鸡体内实质组织细胞及瘤细胞的核膜和细胞浆里可见不同程度的棕黄色阳性反应,可为探讨ALVJ对体内组织细胞的嗜性提供依据。     

狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救

为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因（G）从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒（RV）糖蛋白基因从野生型的第4位（N-P-M-G-L）重排于第1位（G-N-P-M-L）,并成功地拯救已发生基因重排的狂犬病毒．     

RV野毒株的鉴定,毒力实验及其核酸探针的研究

对从我国不同地区、不同动物分离的３个疑似狂犬病毒分离物８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ和无毒疫苗株ＳＲＶ９进行了ＥＬＩＳＡ和核酸探针的鉴定。同时，对它们的致病性和毒力进行了测定。结果表明，３个分离物均为狂犬病病毒，其毒力以鼠源ＭＲＶ最强，牛源ＢＲＶ最弱，同地下同动物分离的ＢＲＶ和ＭＲＶ毒力差异很大。疫苗株ＳＲＶ９对１２ｇ小鼠无致病性，研制的狂犬病毒地高辛标记核酸探针敏感性高，特异性强，适用于对狂犬病病料进     

狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析

利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。     

猪源狂犬病病毒N和G基因的序列分析

通过对新分离的猪源狂犬病病毒GD-SH01株N基因和G基因进行序列分析,解析它们与其他狂犬病病毒N和G基因的差异.提取猪源狂犬病病毒GD-SH01株的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增N基因和G基因,并与T载体连接,克隆至大肠埃希菌DH5α.测序后与国内外部分毒株的N基因和G基因进行核苷酸序列和氨基酸序列比对.与其他毒株相比,N基因核苷酸相似性为84.3%～98.0%;氨基酸相似性为92.5%～99.3%.G基因核苷酸相似性为80.4%～98.2%;氨基酸相似性为87.8%～99.6%.     

狂犬病毒RT-PCR检测方法的建立

根据狂犬病毒保守序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)建立了一种检测狂犬病毒的方法,以期实现对严重危及人和动物生命安全的狂犬病毒直接检测。