中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜实时荧光PCR法鉴别及其应用

中国蜂蜜主要分为中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜两种,分别由中蜂和意蜂酿造而成.中蜂蜂蜜营养价值高,保健功能好,但是由于产量低,价格是意蜂蜂蜜的3～5倍.一些不法企业和养蜂人趁机将意蜂蜂蜜假冒中蜂蜂蜜销售,或将意蜂蜂蜜掺入到中蜂蜂蜜中以次充好.因此,如何鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜是当前蜂产品行业面临的一大难题.本研究以MRJP2(Maj...     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的建立

依据非洲猪瘟病毒(ASFV)的vp73基因保守序列,设计了特异性引物与TaqMan探针,扩增片段69bp,建立了ASFV实时荧光PCR检测方法。与OIE推荐用于检测ASFV的实时荧光PCR和普通PCR方法进行比对,结果显示,本文建立的方法与OIE两种检测方法的特异性相当,灵敏度与OIE荧光PCR方法相当,但比普通PCR方法高出至少10倍。标准定量曲线显示,本文方法最低检测限可达10 copies/μL病毒DNA(相关系数为0.993046)。重复性试验的批内CV值为0.61%～1.14%,批间CV值为1.37%～3.14%,表明本文方法的重复性和稳定性良好。可见,本文建立的基于vp73基因的ASFV实时荧光PCR检测方法具备快速、准确、灵敏的特点,将为检验检疫部门防御ASFV传入我国提供更多技术支持。     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。     

鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

[目的]建立准确、快速检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。[方法]以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计引物和Taqman探针;分别构建标准阳性质粒模板,将其10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性。[结果]建立了鉴别牛种、羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床样品进行检测。[结论]所建立的多重实时荧光定量PCR诊断方法能够快速、准确地鉴别牛种和羊种布鲁菌。     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

实时荧光PCR方法检测禽病毒病的研究

通用探针是实时荧光PCR探针类的一种,具有高度的特异性和灵敏度,可对样品进行准确的定量分析。本试验主要采用该方法对通用探针检测禽病毒病进行了研究,试验结果显示本方法的特异性、灵敏度和Taq Man探针相近,且具有操作简便、费用低廉等优点。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计了1对引物，分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板，采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，确定特异性产物的Tm值，同时做普通PCR。试验结果表明，特异性产物的Tm值为88．5℃，最低能检测到含0．036fg／μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性，为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

实时荧光PCR方法检测禽病毒病的研究

通用探针是实时荧光PCR探针类的一种,具有高度的特异性和灵敏度,可对样品进行准确的定量分析。本试验主要采用该方法对通用探针检测禽病毒病进行了研究,试验结果显示本方法的特异性、灵敏度和Taq Man探针相近,且具有操作简便、费用低廉等优点。     

实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术.它利用荧光实时检测PCR反应,具有灵敏度高、特异性强、节约时间等优点.文章就常用的4种方法,即DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探针的原理和特点进行介绍,同时综述了荧光定量PCR技术在实践中的应用.     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green I实时荧光定量P...     

羊鞭虫病实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测羊鞭虫病实时荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的羊鞭虫(Trichuris ovis)ITS基因序列(登录号:JF680987.1),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,建立检测羊鞭虫病的TaqMan实时荧光PCR方法。对反应体系的特异性、敏感性和稳定性进行评价,并用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R^2=0.994,扩增效率E=1.05。该方法特异性强,与其他8种常见家畜寄生性线虫病不发生交叉反应;灵敏度高,最低检出下限为31.7拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数分别为0.43%~1.04%和1.20%~1.91%,均小于2.00%。用建立的实时荧光PCR方法和显微镜检查方法分别对20份临床样品进行检测,实时荧光PCR和显微镜检查方法检出的阳性样品分别为14和9份。本研究建立的TaqMan实时荧光PCR方法能在粪便中快速、准确、灵敏检测羊鞭虫卵,为羊鞭虫病的检测和防控提供新的方法。     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

实时荧光PCR法检测饲料中鸡源性成分

为控制由动物源性饲料引发的国际和国内动物安全问题提供依据,有必要的进行动物源性饲料中动物种类进行鉴定,本研究根据鸡线粒体DNA建立了Taqman探针实时荧光PCR检测饲料中鸡源性成分方法,该方法的特异性高、灵敏性高、重复性好,在检疫检验部门极具实用价值。     

猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法.使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线.其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.     

实时荧光PCR检测非洲猪瘟病毒

2018年12月27日,农业农村部发布了119号公告,要求在非洲猪瘟防控期间生猪屠宰厂(场)应当在驻场官方兽医组织监督下,按照生猪不同来源实施分批屠宰,每批生猪屠宰后,对暂储血液进行抽样并检测非洲猪瘟病毒。经PCR检测试剂盒或免疫学检测试纸条检测为阴性的,同批生猪产品方可上市销售。本实验随机性选取某屠宰场的1860头生猪(其1860头生猪均来自不同规模养殖场及散养户)的32份混合血液样品,采用郑州中道非洲猪瘟实时荧光PCR试剂盒进行监测,结果表明32份血液样本均为ASFV抗原阴性。由于目前还没有一个统一的生猪屠宰厂样品采集和检测方面有关的要求,也没有出台规范采样、检测和记录等措施。所以本实验是依据某屠宰场的实验室情况制定的实验标准,供大家参考。     

实时荧光PCR和常规PCR方法检测饲料中鸡源性成分

根据鸡线粒体DNA序列,设计并筛选了鸡源性特异引物及探针,建立了饲料中鸡源性成分的常规PCR和实时荧光PCR检测方法,结果表明常规PCR方法最低可以从饲料中检出0.1%的鸡源性成分,实时荧光PCR方法最低可以从饲料中检出0.001%的鸡源性成分。该方法具有很高的特异性和灵敏性,可以作为鸡源性成分鉴别检测的常规方法。     

猪细环病毒实时荧光PCR检测技术的建立及应用

为了实现猪细环病毒(TTSuV)快速检测,给TTSuV的调查、监测和防控提供可行性、操作性强的技术支持。本试验根据TTSuV的序列特点设计特异性引物、探针,应用实时荧光PCR技术检测TTSuV1a型和TTSuV1a1b型。以猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性,TTSuV1a灵敏度可达9.2拷贝/μL,TTSuV1b灵敏度可达5.6×101拷贝/μL;批内变异系数均小于1%,批间变异系数均小于3%。将该方法与PCR法、PCR-DHPLC进行比较,结果证实该方法具有较好的准确性。对92份血清样本进行检测,发现有58份TTSuV1a阳性、62份TTSuV1b阳性、51份TTSuV1a和TTSuV1b共感染阳性。本研究建立的TTSuV实时荧光PCR法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。     

实时荧光PCR检测鸡GAPDH基因方法的建立

根据GenBank上鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料建立了荧光定量PCR法.采用梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR并建立了标准曲线,经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;动力学曲线分析表明,在本研究所建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应.实时荧光定量PCR检测GAPDH基因表达水平标准品质粒和标准曲线的建立,为GAPDH基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.