恩施地区烟草病毒病的电镜诊断与RT-PCR鉴定

采集湖北省恩施地区疑似感染烟草病毒病的新鲜烟叶样品,提纯获取混合样品病毒粒子悬浮液,采用悬滴法进行负染,通过电镜观察对病原物进行初步鉴定。结果显示,病毒粒子悬浮液中存在大量线状、杆状与球状形态病毒粒子。进一步提取混合样品总RNA,使用马铃薯Y病毒属通用引物,TMV、CMV外壳蛋白序列特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物回收克隆用于测序,经BLAST程序与GenBank进行比对,感病样品中检出TMV、CMV、PVY,与电镜所观察到的病毒粒子形态结构一致。     

瞬时表达靶向TMV外壳蛋白基因的siRNA能干扰病毒侵染

 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi途径的重要中介,已被广泛应用于动、植物抗病毒治疗研究。本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因为靶位,设计合成表达小干扰RNA的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121中,直接转化根癌农杆菌。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了同源于TMV外壳蛋白的siRNA对TMV侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的siRNA能够特异性干扰TMV侵染。含有重组表达载体pBI121/siRNA的根癌农杆菌渗入普通烟植株,在TMV接种后14d其上部叶片没有表现典型的花叶症状。对这些叶片进行Northern杂交试验也没有检测到TMV病毒的RNA积累或仅有很少量的积累。在枯斑寄主心叶烟上,siRNA的瞬时表达可使TMV侵染后的枯斑数明显减少,甚至不产生枯斑。此外,同源于TMV外壳蛋白的siRNA瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)没有抑制作用,表明siRNA的干扰作用具有高度的同源依赖性。     

抗TMV生防菌YNLP-2的筛选与鉴定

采用局部枯斑法从云南罗平植烟区烟草根际土壤中筛选了一株对烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)具有显著拮抗活性,且具有Amp筛选抗性的细菌菌株YNLP-2.通过菌体形态鉴定、16S rDNA序列比对和生理生化测定表明该菌株为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus).菌株浓度在5.6×108 cfu/mL时,对TMV抑制效率高达99％以上.透射电镜观察显示B.cereus YNLP-2菌株对TMV病毒粒体的破坏作用表现为该菌株可将TMV典型的杆状病毒粒体破坏成小片段.SDS-PAGE电泳发现该菌株对TMV病毒外壳蛋白无破坏作用.田间抗病毒小区试验显示该菌株对病毒病综合防治效果达到45.65％,与宁南霉素效果相当.     

一套适合烤烟3种RNA病毒的RT-PCR检测方法

烤烟是贵州省的重要经济作物,但是烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)3种RNA病毒在贵州烤烟产区造成巨大损失.3种病毒引起的症状相似性造成了田间诊断的困难.针对贵州烟区的样品,开发了一套包含了靶向3种病毒外壳蛋白基因特异性片段的RT-PCR检测方法.3对引物涵盖的基因片段长度分别为:T...     

基于外壳蛋白基因的湖南烟草黄瓜花叶病毒遗传多样性分析

为探明湖南烟草上发生的黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的遗传多样性及分子进化特征,对来自湖南烟区的303份疑似感染病毒的烟草样品进行检测,分析CMV系统发育、遗传变异和群体结构等特征。结果表明：部分分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)基因与NCBI上登录的CMV分离物的一致性为86.34%～98.42%;系统发育分析发现湖南烟草CMV分离物属ⅠB组,不同组间的分离物地理特征不明显,无重组现象,进化的主要驱动力是负选择;组间遗传变异比较明显,基因交流频率较低,受到遗传漂变影响,遗传多样性高,群体趋于扩张。研究结果为烟草抗CMV育种提供了理论依据,对病害防治具有重要意义。     

甘薯褪绿斑病毒山东分离物全基因组扩增及遗传进化分析

为了解甘薯褪绿斑病毒(sweet potato chlorotic fleck virus, SPCFV)在山东省的发生及遗传进化情况,分别于2019年和2020年采集了131份甘薯样品,针对SPCFV进行病毒检测、全基因序列扩增、序列分析及遗传进化树构建。结果显示：SPCFV两年的检出率分别为7.1%和5.6%,所有SPCFV感染样品中皆为SPCFV与其他病毒的复合侵染。通过RACE和RT-PCR获得CFV-SD1和CFV-SD2两个全基因组序列,全长均为9 105 bp;与已报道分离物核苷酸序列一致性为72.9%～89.5%。全基因组遗传进化分析显示所有SPCFV分离物聚为两簇。且从不同样品中获得6个SPCFV山东分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)序列,基于CP氨基酸序列开展遗传进化分析表明,山东分离物均归于亚洲类群的第一簇(Asian isolates 1)。氨基酸偏好性分析显示,CP氨基酸序列N端前35位同样存在多变区。本研究表明了山东省已成为SPCFV的常发区域,且病毒群体存在多样性,研究结果为指导SPCFV的有效防控提供了理论依据。     

应用实时荧光定量RT-PCR检测几种食用菌蛋白抗烟草花叶病毒的活性

根据烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白(CP)RNA的特异性序列设计TaqMan荧光探针及其引物,利用实时荧光定量RT-PCR检测食用菌蛋白抗TMV的活性。经食用菌蛋白处理后,TMV病毒汁液中TMV的RNA浓度下降了22.02%~87.93%,传统生物学测定的食用菌蛋白抗TMV的平均枯斑抑制率为10.88%～83.97%;相关性分析表明,实时荧光定量RT-PCR测定的病毒RNA浓度的下降与传统生物学方法测定的平均枯斑抑制率之间呈正相关(r=0.818 8),具有较好的一致性。利用实时荧光定量RT-PCR检测蛋白抗烟草花叶病毒活性的方法,具有特异性好、快速、简便、重复性高的特点,适合于蛋白抗烟草花叶病毒活性的痕量快速高效检测。     

青蒿中番茄斑萎病毒和烟草花叶病毒的分子鉴定及相关序列分析

番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus, TSWV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是2种重要的植物病原病毒, 对多种经济作物的产量和品质均造成严重影响。2021年-2022年, 在云南省丽江市烟草种植区不同烟区采集叶片黄化、皱缩以及无症状的青蒿Artemisia caruifolia样品共计14份, 利用免疫金标速测卡和RT-PCR对其病原病毒进行检测。利用免疫金标速测卡检测结果显示, 在所检样品中有9份样品检测出TSWV, 检出率为64.28%, 有3份样品检测出TMV, 检出率为21.43%, 2种病毒复合侵染的检出率同样为21.43%;利用RT-PCR对复合侵染的3份样品进行分子检测, 结果显示, 在3份复合侵染青蒿样品中获得3条TSWV N基因序列、3条TMV cp基因序列和2条TMV RdRp部分序列。TSWV青蒿分离物与分离自云南的TSWV-2分离物相似性最高, 为99.6%;TMV青蒿分离物与分离自辽宁的TMV-Shenyang分离物和分离自云南的TMV-Yongren-1相似性最高, 均大于99.4%。这是首次发现TSWV和TMV 2种不同属病毒复合侵染青蒿。     

扁穗冰草rDNA-ITS序列测定及分析

提取青藏高原环湖地区扁穗冰草35个样品的DNA,采用PCR产物直接测序的方法,对扁穗冰草rDNA的ITS区(包括ITS-4和ITS-5)进行序列测定.结果表明:扁穗冰草ITS序列总长度为649bp,其中有17个变异位点,扁穗冰草物种水平的Hd、Pi分别为0.916和0.00320,表明扁穗冰草物种水平上的遗传多样性相对较高.AMOVA分析表明,扁穗冰草大部分的遗传变异发生在居群内(77.62％),在系统发育树中,虽然4个地区样品聚为3支,但是每一支中不同地区的个体混杂在一起.     

南瓜果实中黄瓜绿斑驳花叶病毒的RT-PCR检测及cp基因序列分析

以来自甘肃的南瓜果实样品中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增，序列测定和分析结果表明：扩增片段包含CGMMV的外壳蛋白基因和3’非编码区，证明南瓜果实中存在黄瓜绿斑驳花叶病毒，将其印基因序列与来自国内不同地区的其他CGMMV分离物进行序列比对，发现国内各分离物间的同源率高，有很近的亲缘关系。     

我国部分地区沙地葡萄茎痘相关病毒分离物外壳蛋白序列变异分析

为明确我国葡萄中沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）的感染情况及病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因的变异特点,从而为其致病性、病害的防治以及抗病毒基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品中的GRSPaV进行RT-PCR检测,根据地区与品种差异选取了24个阳性样品进行cp基因克隆与测序分析,并对不同RNA提取方法进行了比较。结果显示,114株样品被GRSPaV侵染,平均带毒株率为37.4%;分离物间及同一分离物不同克隆间的序列差异较大,从24个分离物克隆获得的37条cp基因序列与来源于不同国家的12个GRSPaV分离物的核苷酸序列同源性为80.5%~99.7%,氨基酸序列同源性为88.8%~100%;各个分离物的遗传距离无明显地域差异;SiO₂吸附法比SDS法和CTAB法更适宜葡萄样品RNA的提取。     

侵染葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒广西分离物分子鉴定

从广西南宁市郊温室大棚中的葫芦[Lagenaria siceraria(Molina)Stand.]上采集到一个表现脉绿、花叶症状的病毒样品,ELISA检测表明,该样品与黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)有密切的血清学关系,利用RT-PCR方法从样品中扩增获得约500bp的DNA片段,序列分析表明,该片段是CGMMV的外壳蛋白基因,暂将该病毒分离物定名为GX-BG。外壳蛋白基因核苷酸序列系统进化树分析表明,已报道的CGMMV主要分为3大群体,GX-BG与中国辽宁分离物(CGMMV-LN)分别属于不同的群体。     

贵州黔西南烟草中辣椒脉斑驳病毒的鉴定及遗传多样性分析

为明确贵州黔西南烟草中辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus, ChiVMV)的遗传多样性和分子进化特征,本研究以2021—2022年采集自贵州省黔西南州兴义市的52份疑似感染ChiVMV的烟草样品为实验材料,利用马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用引物和ChiVMV特异性引物进行RT-PCR检测、克隆和测序,并结合GenBank中已公布的相关序列对分离获得的16个ChiVMV贵州烟草分离物进行基于外壳蛋白(coat protein,CP)CP基因的遗传多样性和分子进化分析。结果显示,所获得的ChiVMV贵州烟草分离物与GenBank中其他36个分离物CP基因的核苷酸一致性为84.79%～99.65%;基于ChiVMV CP基因的系统进化分析发现,52个不同来源的ChiVMV分离物在进化上可以聚为3个不同的分支,聚类结果具有明显的地理分布特征;遗传多样性和进化分析结果表明,各群体受到地理分布的影响而表现出较高的遗传多样性,各群体间的遗传分化显著且基因交流频率较低。研究结果为ChiVMV抗病品种的选育和该类病毒病的防治具有重要意义。     

三环己基氯化锡对烟草花叶病毒的抑制作用

以心叶烟为试材,采用活体钝化法测定了三环己基氯化锡对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用,并通过电镜、琼脂糖凝胶电泳及紫外光谱法分别测定了三环己基氯化锡对TMV、TMV-RNA及TMV-外壳蛋白(TMV-CP)的体外作用。活体钝化结果显示:500 μ g/mL的三环己基氯化锡对TMV的抑制率达到75.77%±0.11% (P<0.01);三环己基氯化锡与TMV体外作用30 min,电镜下观察,显示病毒粒体出现断裂现象,粒体结构遭到破坏;琼脂糖凝胶电泳显示,三环己基氯化锡对TMV-RNA具有体外降解作用;紫外光谱法测定结果表明,三环己基氯化锡对TMV-CP的体外聚合过程具有抑制作用。     

五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测

 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV),通常发生复合侵染。本研究对我国5种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,通过优化引物和模板浓度,摸索扩增参数,在一个体系中成功对5种病毒复合侵染的烟草材料进行多重RT-PCR扩增,得到237、273、347、456和547 bp共5条特异性条带,建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的多重RT-PCR检测体系。对田间样品检测结果证明,多重RT-PCR体系能够同时检测5种病毒,并且灵敏度高。     

太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%~99.0%之间,氨基酸序列同一性在93.5%~99.3%之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBW V2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。     

接种烟草花叶病毒后不同抗性番茄品系叶片可溶性蛋白组成的变化

 用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析了不同抗性番茄等基因系GCR-267和GCR-267的叶片可溶性蛋白组成在接种TMV番茄O株后的变化。实验发现敏感品系GCR-26的叶片可溶性蛋白的组成,与健株相比较,TMV侵染株发生显著的变化。接种后7天,除一部分蛋白质含量减少外,还有四种为健株及抗性品系TMV接种株所没有的新蛋白质产生,它们在10%凝胶上的迁移率分别为Rf0.31、0.33、0.39和0.45,其中Rf0.38和Rf0.39两种蛋白质含量极大。接种后10天Rf0.31和Rf0.45两带趋于消失,但Rf0.33和0.39两带继续积累。经电泳和免疫双扩散试验证明Rf0.33蛋白带是TMV外壳蛋白:Rf0.39蛋白带与TMV外壳蛋白无关。该蛋白也不具有过氧化物酶,多酚氧化酶、酸性磷酸酶、酯酶、苹果酸脱氧酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶的催化活性,分子中不含有糖类物质。SDS-PAGE测定其分子量为14,200道尔顿。
抗性品系GCR-267的TMV接种株的叶片可溶性蛋白组成未出现象感病品系GCR-26那样的变化。
讨论了这种变化与番茄抗、感病性之间的关系。     

云南、福建、湖南烟区烟草花叶病主要病毒种类检测及黄瓜花叶病毒亚组鉴定

 采用抗原直接包被和双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)对采自云南、福建、湖南烟区烟草花叶病样品进行了病毒种类检测,利用三抗体夹心ELISA对黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的亚组类型进行了鉴定。在云南采集的520个花叶病样品中,烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、CMV和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)总检出率分别为71.74%、55.01%和6.35%;在福建采集的150个花叶病样品中,TMV、CMV和PVY的总检出率分别为94%、24.66%和8.00%;在湖南采集的74个花叶病样品中,TMV、CMV和PVY的总检出率分别为58.11%、51.35%和2.70%。部分样品为2种以上病毒复合侵染。云南、福建和湖南采集的64个CMV阳性样品中,属亚组Ⅰ的样品为57个,占89.1%;属亚组Ⅱ的样品为10个,占15.6%;其中3个样品为亚组Ⅰ和亚组Ⅱ的复合侵染。     

进境番茄种子中番茄花叶病毒的检测与鉴定

利用双抗夹心 酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)和反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对来自韩国的番茄种子进行种传病毒检测。结果表明,在该批番茄种子中检测到番茄花叶病毒（ToMV）和烟草花叶病毒（TMV）。PCR产物测序结果表明,ToMV特异引物（ToA/ToB）与TMV特异引物（TA/TB）扩增的片段均为ToMV的外壳蛋白（CP）基因及3′非编码区（3′ UTR）,该片段与其他ToMV分离物的核苷酸序列相似性为98.2%~99.9%。本研究利用重新设计合成TMV和ToMV特异引物对该批种子进行RT PCR检测,仅ToMV特异性引物（ToMf1/ToMr1）扩增到670 bp的预期片段,TMV特异引物（TMf1/TMr1）则未出现特异性扩增,表明重新设计的引物可准确区分ToMV和TMV。以上结果证实该批番茄种子仅携带ToMV。