日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析

[目的]纤维素合酶(cellulose synthase,CesA)在植物纤维素合成途径中发挥主要调节作用,是控制木材纤维品质和产量的重要基因.从日本落叶松中分离克隆与纤维素合成相关的LkCesA基因,并对其进行核苷酸多样性以及连锁不平衡分析,为在日本落叶松中开展基于LkCesA基因的连锁不平衡作图及其辅助日本落叶松木材纤维性状的分子育种提供理论依据.[方法]依据日本落叶松转录组数据库检测到的纤维素合酶(CesA)基因ESTs序列设计引物,从日本落叶松中分离获得LkCesA基因片段.在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列进行核苷酸多样性和连锁不平衡分析.[结果]从日本落叶松中成功克隆了CesA基因片段:该片段长1 209 bp,包含部分开放阅读框,长度为1 053 bp,可编码350个氨基酸,所推导的蛋白质氨基酸序列与火炬松Pt-CesA2的蛋白质氨基酸序列同源性为95.4％.在日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列中共检测到83个SNP位点,SNP发生频率为1/21 bp,多样性指数πT为0.006 05.在这些SNPs中,69个属于转换,14个属于颠换,其中19个为常见SNPs,64个为罕见SNPs.在外显子区域,共检测到54个SNP位点,其中34个为错义突变,20个为同义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNP连锁不平衡程度逐渐减弱.[结论]克隆到的LkCesA为植物CesA基因家族中的一员.LkCesA基因的连锁不平衡在基因内部就已衰退,说明选择该基因作为候选基因,在日本落叶松中开展连锁不平衡作图用于指导日本落叶松的定向培育及木材品质改良是可行的.此外,在LkCesA基因中检测到多个常见SNP位点,为进一步开展该基因的连锁不平衡作图提供了材料.     

107杨次生木质部PAL基因的RT-PCR扩增及其鉴定

木质素是一种由肉桂醇等单体聚合而成的酚类多聚体,是植物体中一种主要的天然产物,广泛存在于维管植物中。木本植物中木质素含量较高,一般约占干重的15 %～36 % (Douglas ,1996 )。木质素与纤维素、几丁质一起成为世界上最丰富的天然多聚物之一,是仅次于纤维素而居第二的有机组     

毛白杨纤维素合酶基因PtCesA4的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3 757 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3 129 bp,可编码长度为1 042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA,和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%.组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成熟木质部和成熟木质部中表达丰度最高,在根部和顶端分生组织表达丰度中等,在树皮和韧皮部有少量表达,在形成层中表达丰度最低.在此基础上,组合利用MEGA3.1和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtCesA4序列进行比对和分析,检测到153个单核苷酸多态性(sinsh nueleotide polymorphism,SNP)位点,SNP频率为1/35 bp,多样性指数π/0.005 02.其中51个是常见SNPs,102个为罕见SNPs.在这些SNPs中,有118个属于转换,35个属于颠换.在外显子区域,共检测到69个SNP位点,其中59个为同义突变,10个为错义突变.对PtCesA4基因内SNPs进行的连锁不平衡分析结果显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部迅速衰退,因此,在毛白杨中,基于PtCesA4基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的.也是不必要的.研究结果为毛白杨PtCesA4基因的连锁不平衡作图及其基因辅助毛白杨木材纤维性状的分子育种提供了理论依据.     

大青杨纤维素合酶PuCesA6全长基因的获得及分析

为给大青杨纤维素方面的基因改良提供基础,以大青杨叶片总DNA为模板,根据已登录的欧洲颤杨PtrCesA6序列保守区段设计2对引物进行PCR扩增,将得到的2个片段克隆到pMD18-T载体中.测序后拼接2片段,结果显示,该基因全长5 760 bp,与欧洲颤杨的PtrCesA6全长cDNA的相似性为99%,证明克隆的序列为纤...     

欧美杨107基因转化受体系统的建立

以欧美杨107为研究对象,通过建立叶片再生系统及抗生素敏感性试验,确立了稳定高效的基因转化受体系统。结果表明,欧美杨107叶片在MS 0.4-1.0mg.L-16-BA 0.05-0.15mg.L-1IAA 3%蔗糖 0.5%琼脂的培养基中可直接再生不定芽,再生频率达100%,平均再生芽数为4个以上。抗生素敏感性试验表明,可以选用15mg.L-1的卡那霉素或5mg.L-1的潮霉素进行抗性芽的筛选。     

毛白杨纤维素合酶基因(PtoCesA1)的克隆及其在烟草中的遗传转化

克隆毛白杨纤维素合酶基因(PtoCesA1),全长为3 215 bp,与欧洲颤杨的PtrCesA1基因的同源性为97%,具有开放的阅读框,编码区在52～2 988碱基之间,为2 937 bp.构建PtoCesA1基因的全长正义植物表达载体为pBIPA1,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确.通过农杆菌介导的方法将pBIPA1表达载体转入烟草中,转基因植株的纤维细胞壁厚度和木质部厚度都有不同程度的下降,形态表征为植株明显变矮,叶片变小.     

毛白杨纤维素合酶基因家族部分成员的克隆及表达

从毛白杨中分离7个纤维素合酶基因,分别为PtoCesA4,PtoCesA5,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA13,PtoCesA17和PtoCesA18,通过与已公布的毛果杨全基因序列及拟南芥和水稻基因组中纤维素合酶基因序列的同源性比对分析,结合目前纤维素合成机制的研究进展,预测毛白杨中上述不同纤维素合酶的功能。利用GenomeLabTMGeXP遗传分析系统分析毛白杨中纤维素合酶基因在不同组织中的转录表达水平,结果表明PtoCesA4,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA17和PtoCesA18在木质部高丰度表达,推测这些基因可能参与毛白杨次生细胞壁的形成,为毛白杨次生细胞壁中纤维素的合成调控提供参考依据。     

黄芪鲨烯合酶基因的克隆和序列分析

参照豆科其他植物的鲨烯合酶基因序列设计了引物,通过逆转录PCR方法,从荚膜黄芪（Astragalus mem-branaceus（fish.）Bge）中克隆了鲨烯合酶基因cDNA序列（GenBank登录号HQ829974）。通过BLAST发现黄芪鲨烯合酶推测的氨基酸序列与大豆鲨烯合酶（BAA22559.1）序列相似性最高,达到了88%。黄芪鲨烯合酶的克隆为以后通过基因转化提高黄芪皂苷含量亦或通过生物工程手段生产黄芪皂苷打下基础。     

欧美杨107的制浆性能

为给欧美杨107应用空间的扩大提供理论依据,对其木材的化学组成成分、纤维形态、制浆性能及纸张的物理指标进行了测定分析.结果表明:欧美杨107的综纤维素含量为81.07%,硝酸-乙醇纤维素含量为48.59%,木质素含量为z1.08%,1%NaOH抽提物含量为19.39%,欧美杨107的纤维平均长度为1171 um,长宽比为57.54,壁腔比为0.56,且纤维长度呈现正态分布趋势;在保温时间60min,硫化度24%,蒽醌用量0.1%的条件下,对于未漂浆而言,欧美杨107硫酸盐-蒽醌法制浆工艺条件为14%的用碱量,最高温度为168℃;对于漂白浆而言,欧美杨107的制浆工艺条件为16%的用碱量,最高温度168℃;在相同的制浆条件下,用碱量为14%时的纸张综合强度指数较用碱量16%时高.     

修枝季节与强度对欧美杨107幼树生长的影响

以5年生欧美杨107为试验材料,研究不同季节、强度修枝对幼树生长的影响。结果表明:不同季节修枝对其生长影响差异显著,冬、春、夏季修枝的平均树高分别为16.2、16.5、15.1 m,比对照分别增长17.4%、19.6%、9.4%,胸径14.2、14.8、13.7 cm,比对照分别增长2.2%、6.5%、-1.4%;随修枝强度增加,高生长呈上升趋势,胸径生长呈下降趋势,但差异不显著;在各处理组合中春季萌芽前修除基部第1冠层(J2Q2)效果最好,其树高17.2 m,胸径15.2 cm,分别比对照增长24.6%、9.4%。但春季修枝易萌条,修枝后要及时抹芽除萌,降低消耗,提高修枝效果。     

多胺物质对农杆菌介导欧美杨107遗传转化影响的研究

利用多胺对携带植物表达载体pBI121的农杆菌EHA105进行活化,之后侵染欧美杨107的叶环.GUS瞬时表达分析表明多胺活化使农杆菌的侵染效率增强,腐胺和亚精胺处理分别为对照的2.4倍和1.8倍.可见使用多胺活化农杆菌有助于提高杨树的转化率.     

修枝对欧美杨107杨水分生理的影响

以欧美107杨为研究对象,从树干液流、蒸腾速率(Tr)以及叶水势(LWP)等杨树水分生理指标角度,探讨修枝处理对这些生理指标在生长季(6—9月)内的影响及其变化规律,并做相应的分析和讨论。试验地Ⅰ以4年生107杨为样木,试验地Ⅱ以6年生107杨为样木。试验地Ⅰ,Ⅱ均设计3个处理组,每个处理组设有3种处理,即对照处理CK(不修枝)、中度处理P1(修掉树冠高度的1/3)、重度修枝P2(修掉树冠高度的2/3)。研究结果表明:1)发生旱情季节(6—8月),液流通量及液流速率呈现P1>CK>P2的规律;正常月份(9月),液流通量及液流速率呈现出CK>P1>P2的规律;P1的液流通量及速率在旱季或正常月份大小基本相同。这表明同正常月份未修枝CK相比,适当修枝(P1)使杨树树干液流始终保持在一定的较低水平,抗旱能力得到一定程度的提高。2)整个生长季内,蒸腾速率(Tr)和叶水势(LWP)都呈现出CK相似文献   

欧美107杨伐根嫁接法造林技术与效果分析

在采伐迹地上,以意大利214杨的伐根做砧木,欧美107杨的1a生条做接穗,进行嫁接法造林技术试验。结果表明,该法造林具有成本低、适应性强、速生等特点。7a生的伐根嫁接法造林的树木平均胸径18.9cm,平均树高19m,单株立木材积为0.1562m3;而利用植苗法造林的同龄树木平均胸径为7.7cm,平均树高为8.4m,单株立木材积为0.0174m3,差异显著。     

豫北地区107杨与中林46杨造林对比试验

对欧美杨107号与当地主栽品种中林46杨的生长量、落叶时间、病虫危害等多项指标进行对比试验研究, 结果表明,欧美杨107号具有速生、抗性强、落叶迟、生长期长等优良特性,可在豫北地区栽培推广。     

欧美杨110号引种及栽培技术

派间杂种雄株 110号杨是国家科技攻关专题“杨树纸浆材林良种选育及培育技术研究”和“欧美杨胶合板材及纸浆材新品种选育”课题组耗时十余载选育出的具有优良特性的杨树新品种 ,已通过国家鉴定。它在耐旱、耐寒、速生以及抗病虫害等方面都堪称优良品系 ,已被国家林业局列为我国西北及华北地区重点推广的树种之一。山西长治市林业技术推广站于 2 0 0 0年初承担了欧美杨 110号杨树丰产林培育项目 ,在 12个县、市、区经过 3a的引种、栽培及推广 ,现已成功完成项目任务 ,并已向全市及周边市、县、区辐射推广。1　欧美杨 110号的优良特性(1)生长…     

Cloning and Sequence Analysis of a Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Gene PsG6PDH from Freezing-tolerant Populus suaveolens

A 1 207 bp cDNA fragment (PsG6PDH) was amplified by RT-PCR from cold-induced total RNA of the freez- ing-tolerant P. Suaveolens, using primers based on the highly conserved region of published plant glucose-6-phosphate dehydro- genase (G6PDH) genes. The sequence analysis showed that PsG6PDH coding region had 1 101 bp and encoded 367 predicted amino acid residues. Moreover, the nucleotide sequence of PsG6PDH showed 83%, 82%, 79%, 79% and 78% identity, and the derived amino acid sequence shared 44.2%, 44.7%, 42.0%, 40.5% and 43.9% identity with those of the Solanum tuberosum, Nicotiana ta- bacum, Triticum aestivum, Oryza sativa and Arabidopsis thaliana, respectively. The results show that PsG6PDH is a new member of G6PDH gene family and belongs to the cytosolic G6PDH gene. This is the first report on cloning of the G6PDH gene from woody plants.     

版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆与序列分析

以版纳龙竹基因组DNA为模板,采用前人基于水稻CO同源基因Hd1序列的保守区所设计的特异引物COS1和COA1,运用PCR方法扩增出一条1 520 bp的DNA片段,并克隆到pGEM-T载体。测序和序列分析结果显示:该片段含有1个590 bp的内含子,编码区930 bp共编码310个氨基酸;该基因被命名为DxCO1,其DNA序列在G enB ank中的注册号为GQ358925。在G enB ank中进行同源性检索的结果显示:其核苷酸序列与其它禾本科植物CO同源基因的氨基酸序列同源性高达81%~91%;推测的DxCO1蛋白质序列与其它种子植物CO同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示:DxCO1与小麦Hd1-like等5个基因聚成了一个强烈支持的分支;另外,在该片段推测的蛋白质序列的氨基端含有一个类似锌指蛋白的B-box(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)结构域,羧基端含有一个CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。序列和结构的高度同源性表明:DxCO1是版纳龙竹的1个CO-like基因,可能对其开花调控有着重要作用。     

油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表达载体构建

α-桐酸合成酶是控制亚油酸向α-桐酸(18:3Δ9cis,11trans,13trans)转化的关键酶。本研究以发育中的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α-桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,长度为1221bp。通过生物信息学分析结果表明,该序列5’端和3’端非编码区序列长度分别为13bp和47bp,含有一个开放阅读框(14～1174bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域。将所得基因经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建反义表达载体pBI121fadx。