4 个斧文蛤群体微卫星标记的遗传多样性分析

为研究斧文蛤(Meretrix lamarckii)不同地理群体(浙江苍南群体、福建长乐群体、福建宁德群体以及广东汕头群体)的遗传结构和系统发生关系,采用13对微卫星分子标记,对4个不同地理群体进行了分析。结果显示,13对引物共检测出63个等位基因,每个位点等位基因数(Na)2~7个,平均每个位点观测等位基因数(Na)为4.87;有效等位基因数(Ne)为1.927~2.591;平均观测杂合度(Ho)为0.437~0.562;平均期望杂合度(He)为0.446~0.549;平均多态信息含量(PIC)为0.383~0.490;Hardy-Weinberg平衡检验表明,4个群体的大部分微卫星位点都偏离平衡状态(P0.05);UPMGA聚类分析表明,浙江苍南群体与福建宁德群体聚为一支,福建长乐群体和广东汕头群体聚为一支;群体间遗传变异指数Fst为0.230 9,表明4个斧文蛤群体间的遗传变异为23.09%。研究表明,斧文蛤4个不同地理群体遗传多样性处于中等多态水平;4个群体的遗传距离与它们实际的地理分布情况基本一致;4个地理群体间的变异较大,遗传分化水平较高。该研究为斧文蛤种质资源的有效保存、管理和恢复提供了理论依据。     

仿刺参的微卫星标记

为了评价种质资源及基础生物学研究的需要,本文开发了仿刺参的微卫星标记。NCBI数据库中共有20个含有仿刺参微卫星的序列,从中选取8个设计引物,发现6个微卫星位点有多态性。不同的引物获得的等位基因数为3～9个不等,6个位点共获得了31个等位基因,每个位点平均获得5．2个等位基因。6个位点的平均观测杂合度（Ho）为0．3611,平均期望杂合度（He）为0．6402。位点AJMS004提供的多态性信息含量值较低,为0．4862;其他5个位点均在0．5以上。另外,还尝试了红海参（Parastichopus californicus）微卫星标记在仿刺参的通用性。实验结果表明,在较高的退火温度下,5对引物均能扩增仿刺参的基因组DNA并具多态性。5个位点共获得了22个等位基因,每个位点平均获得4．4个等位基因。5个位点的平均观测杂合度（Ho）为0．1733,平均期望杂合度（He）为0．4201。其中位点Psc2的多态性信息含量值最高,为0．8500。     

利用微卫星标记对文蛤4个壳色花纹品系的遗传分析

利用9个微卫星位点对文蛤红壳(RS)、黑斑(BS)、细纹(TC)、暗纹(DF)4个壳色花纹品系共120个个体进行遗传差异分析。结果共检测到105个等位基因,每个位点平均观察等位基因数为11.7个,其中WG07位点等位基因数最多(21个),WG11位点最少(7个)。每个品系均具有特异等位基因类型,不同品系中相同微卫星位点的等位基因分布规律不同。4个文蛤品系的观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量变异范围分别为0.110～1.000、0.486～0.867、0.433～0.834,均属高度多态性位点。Hardy-Weinberg平衡的卡方检测发现,大多数位点偏离平衡状态;聚类分析表明,4个品系间存在较明显的遗传差异,TC品系与其它品系的遗传距离最大,DF品系和RS品系的遗传距离相对较小。     

人工蓄养斧文蛤的生殖周期及早期发育

为了探讨斧文蛤(Meretrix lamarkii Deshayes)的繁殖规律和胚胎发育过程,自2012年1月至2013年1月,每月采集样品,采用组织学方法对浙南海区移养的斧文蛤性腺发育、生殖周期和性成熟率周年变化进行了研究,并结合室内人工育苗试验对其胚胎发育过程进行了显微观察。结果表明,该地区斧文蛤的性腺发育以1年为1个周期,可分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期,雌雄性比约为1:1,性腺发育时间基本同步,均始于2月,随着水温的升高而发育,大部分个体在6月至7月发育成熟,7月下旬至8月底是繁殖盛期,可用阴干加流水刺激方法诱导其排放精卵,受精卵在水温29℃、盐度28、p H 7.8~8.5条件下,经16~20 h孵化成D形幼虫,壳长为100~110μm,浮游幼虫经5~6 d培育进入匍匐幼虫期,壳长约200μm,最后发育变态为稚贝。本研究为斧文蛤的人工繁育、养殖开发以及种质资源保护提供了基础资料。     

虾夷扇贝EST-SSR标记在栉孔扇贝中的通用性研究

为研究虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)的群体遗传多样性并分析其亲缘关系,对在虾夷扇贝中开发的60个EST-SSR位点在栉孔扇贝中的通用性进行了研究。结果显示,21个位点可在栉孔扇贝中扩增出特异性条带,通用性比例达35.00%,其中,17个位点具有多态性,多态性比例达28.33%。在虾夷扇贝和栉孔扇贝群体中,平均等位基因数(N_a)分别为2.7647和2.3529;平均有效等位基因数(N_e)分别为1.9487和1.6350;平均观测杂合度(H_o)为0.6314和0.3333;平均期望杂合度(H_e)为0.4569和0.3139;平均多态信息含量(PIC)为0.3726和0.2597;Nei's(1973)基因多样性指数(I)分别为0.4493和0.3087;Shannon信息指数分别为0.7176和0.5041;固定指数(F_(is))检测发现,7个位点偏离了Hardy-Weinberg平衡;遗传分化系数(F_(st))为0.2398。本研究开发的21对通用性EST-SSR标记,为进一步开展虾夷扇贝和栉孔扇贝遗传多样性分析、分子辅助育种、基因发掘和种质资源评价奠定了基础。     

牙鲆微卫星标记的开发及多态性分析

将牙鲆基因组DNA经限制性内切酶RsaⅠ和BstUI双酶切后采用FIASCO法构建酶切片段基因组文库。共挑取269个克隆,177个为阳性克隆,阳性克隆率为65.79%。经测序后获得191条微卫星序列,其中完美型占74.35%;非完美型占14.66%;混合型占10.99%。用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物153对,挑选其中的50对合成并在32个野生牙鲆个体中进行扩增,共31个位点具有多态性,统计结果后使用POPGENE软件进行分析,平均等位基因个数为3.939 4,平均有效等位基因数为3.052 2,平均观测杂合度为0.650 1,平均期望杂合度为0.586 6,各引物的Hardy-Weinberg平衡指数在0.012 587~0.984 917变动。这些筛选出的多态性微卫星标记可应用于进一步的牙鲆遗传多样性分析、家系分析及遗传图谱的构建等工作中。     

斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化

采用电镜和荧光显微镜技术,对斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化进行了系统研究。电镜观察表明,斧文蛤精子为鞭毛型,全长45.2~47.7 μm,由头部、中段和尾部三部分组成。头部呈稍弯曲的狭茧形,长约2.5 μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈圆锥形,内部中轴处有亚顶体腔;细胞核为长锥形,有核前窝和核后窝。中段由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个近球形的线粒体呈单层梅花状排列;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,远端中心粒延伸出尾部的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,内部的轴丝呈典型的“9+2”结构,外周有波浪状质膜包被。用荧光显微镜观察了斧文蛤受精及早期卵裂过程的细胞学变化,结果发现,斧文蛤成熟未受精卵呈圆球形,核相处于第一次成熟分裂中期;在水温27~28 ℃条件下受精,受精后6 min,精子入卵并膨胀成球形;受精后12~15 min、20~25 min受精卵排出第一、第二极体;30 min左右,精、卵核膨胀形成雄、雌原核;35 min,两性原核在卵子中央发生染色体联合;40~45 min,受精卵进行第一次卵裂,形成2个大小不等的分裂球;55~60 min,第二次卵裂结束,形成1大3小4个卵裂球,核相变化与第一次卵裂基本相同;75~80 min,第三次卵裂完成,自此次起开始进行螺旋分裂。另外,在斧文蛤受精过程中发现了约1%的多精入卵现象,其对成熟分裂和早期卵裂过程影响很大,常造成成熟分裂紊乱和第一次卵裂染色体分离异常。     

丽文蛤与文蛤4个地理群体的形态差异分析

对丽文蛤和文蛤的可量性状进行了单因子方差分析、主成分分析、聚类分析和判别分析,比较了两者的形态差异。单因子方差分析结果显示,丽文蛤与文蛤在10个比例性状中存在着7~8个显著差异(P0.05)。主成分分析和聚类分析结果显示,文蛤不同地理群体为一组,丽文蛤为另一组。主成分分析构建了4个主成分,其贡献率分别为26.70%、17.04%、13.82%和10.40%,累计贡献率为67.95%。第一主成分主要受楯面长/壳长、小月面长/壳长的影响。判别分析结果显示,丽文蛤与文蛤4个地理群体的形态差异显著(P0.05)。建立了5个判别函数,其判别准确率P1为69.51%~98.75%,P2为76.67%~95.18%,综合判别率为82.80%。     

泥蚶34个EST-SSR标记的开发及在格粗饰蚶中的通用性检测

利用泥蚶转录组高通量测序、拼接获得的大量EST序列开发SSR标记,在1123条EST序列里筛查到73条含有SSR位点的EST序列,其中54个位点适合设计引物,在位点两侧设计引物并进行PCR扩增.结果显示,46对引物获得稳定扩增的位点,引物在泥蚶奉化群体的多态性检测中发现,有34对引物表现出多态性,共扩增出122个等位基因,各位点的等位基因数Na为2～7个,平均每个位点产生3.59个等位基因,观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000 ～ 0.600、0.078 ～0.771、0.106～0.718;Hardy-Weinberg平衡检测显示,13个位点偏离了平衡状态;用Nr和Swiss-Prot蛋白质数据库对含有多态性SSR的EST进行了基因注释,25个SSR位点来自注释基因序列.将34对泥蚶多态性SSR引物在格粗饰蚶中进行了通用性检测,结果有1 1对成功扩增,8对表现为多态,通用率为23.53％,这些通用引物可用于两种蚶的遗传多样性评价、系统进化分析、比较作图和基因发掘等研究.     

文蛤属2种贝类多变量形态分析及日本文蛤的物种有效性

为探讨日本文蛤与中国文蛤属2种贝类的形态差异及日本文蛤的物种有效性,采用多变量形态度量,结合传统分类方法,获得日本文蛤和中国大陆文蛤属2种贝类8个形态比例性状,并做单因素方差分析、聚类分析、主成分分析、判别分析及Mantel检验。结果表明,(1) 单因子方差分析显示,日本文蛤与中国大陆文蛤属2种贝类,在8个比例性状中存在着5~8个显著差异(P<0.05);(2) 聚类分析表明,6个文蛤地理种群距离相近,且呈现南北分别聚为一类,而日本文蛤与长乐丽文蛤相近;(3) 主成分分析构建了3个主成分,其贡献率分别为34.88%、18.61%、16.89%,累积贡献率为70.38%,三维主成分散布图进一步表明日本文蛤与丽文蛤均独立于文蛤不同地理种群重叠区之外;(4) 判别分析构建了8个判别函数,判别准确率P₁为39.09%~100%,P₂为47.06%~100%,日本文蛤与中国大陆文蛤属2种贝类的综合判别率为70.60%,其中日本文蛤判别准确率为100%,丽文蛤判别准确率高于91.67%;(5) Mantel检验结果表明,各种群间的地理距离与欧氏距离之间存在显著相关性(r=0.623 7, P<0.01)。研究认为,日本文蛤属于丽文蛤,与长乐丽文蛤属于同一种不同地理种群;根据MAYR等提出的75%规则,8个比例性状中有5个性状大于1.28,两个丽文蛤群体已达到亚种水平。     

文蛤卵母细胞卵黄发生的超微结构

取不同发育阶段文蛤 (MeretrixmeretrixLinnaeus)活体解剖取出生殖腺 ,常规方法制成切片 ,以透射电镜(TEM )观察其卵母细胞的卵黄发生过程。结果表明 ,文蛤的卵母细胞卵黄发生期间 ,线粒体、内质网、高尔基复合体、溶酶体、微吞饮泡等细胞器均参与了卵黄粒的形成。卵黄合成早期的卵母细胞质膜伸出大量的微绒毛 ,并出现卵黄膜 ,胞质中有大量膜性小泡 ,溶酶体、线粒体、高尔基复合体和粗面内质网发达 ,卵黄前体物质逐渐增多。在卵黄合成中期 ,胞质内线粒体和内质网活动活跃 ,卵母细胞大量合成和积累卵黄物质 ,细胞质膜外凸 ,与外界进行物质交换。卵黄合成后期 ,卵质内贮存了大量的卵黄粒 ,细胞器不发达。此外 ,还对卵母细胞发育过程卵黄颗粒的细胞内、外原料来源进行了讨论     

文蛤人工育苗试验

为了给文蛤苗种生产提供技术依据,以促进文蛤养殖业的发展,进行了文蛤的室内人工育苗试验。亲蛤取自浅海滩涂,催产后在水温21～24℃、水体比重1.015～1.020、弱光条件下孵化,再在自然水温、水体比重1.015、光照500 lux、溶氧5 m g/L以上,pH 8.0～8.6条件下培育幼虫,投喂金藻、角毛藻和扁藻,幼体开始营底栖生活时投放附着基。结果,从受精卵发育至稚贝的育苗率近60% ,从D形幼虫到稚虫的成活率为94% 。     

文蛤规模化养殖技术开发

通过不同苗种规格、养殖密度等试验,确定了文蛤滩涂大规模养殖技术和保护性合理采捕技术,形成了滩涂潮间带文蛤高产养殖模式集成技术。专家鉴定认为,该成果总体水平达到国际先进。     

文蛤消化道粘液细胞研究

运用组织学和组织化学染色方法,在光镜水平上研究了文蛤消化道粘液细胞的类型,分布与组化特性。H.E染色法显示,粘液细胞主要存在于消化道上皮组织中,仅唇瓣结缔组织中发现有少量的粘液细胞,ABPAS染色法显示;文蛤消化道粘液细胞主要分为4种类型：Ⅰ型,呈红色,AB阴性,PAS阳性,含有中性粘液物质,Ⅱ型：呈蓝色,AB阳性,PAS阴性,含有酸性粘液物质;Ⅲ型：AB和PAS均呈阳性,但PAS阳性较强,两种粘液物质均含有,但中性粘液物质含量多;Ⅳ型：AB和PAS均呈阳性,但AB阳性较强,两种粘液物质均含有,但酸性粘液物质含量多,不同部位粘液细胞的类型,数量不同,唇瓣粘液细胞的数量较少,食道含有大量的粘液细胞,胃,肠,直肠中粘液细胞的数量以胃中最少,肠次之,直肠最多,AB-PAS（AB pH1.0）染色法显示：粘液细胞所含酸性粘液物质包括硫酸性粘液物质和涎酸性粘液物质,且唇瓣和直肠中粘液细胞所含的涎液酸性粘液物质比硫酸性粘液物质多,酶组化研究结果显示,肠粘液细胞具有弱酸性磷酸酶,弱碱性磷酸酶活性。     

文蛤牛首科吸虫寄生病的组织病理学

报道了一种牛首科（Bucephalidae)吸虫幼虫在文蛤体内的寄生情况以及所引起的组织病理学变化。观察结果表明,该吸虫幼虫主要侵占生殖腺,少部分进入附近的消化盲囊、鳃、外套膜和足等。消化道中未发现其存在。寄生虫不仅破坏已感染的组织,未感染部位的组织结构也呈现一定的病理学变化。严重感染时,生殖腺完全被吸虫幼虫侵占;消化盲囊、消化道和鳃等器官组织的上皮细胞脱落或溃散;肌肉紊乱或溶解等。严重者导致器官组织坏死,贝类死亡。     

文蛤池塘养殖几种模式的对比试验

文蛤（Meretrix meretrix Linnaeus）是一种埋栖性贝类,隶属于软体动物门,瓣鳃纲,异齿亚纲,帘蛤目,帘蛤科。一般生活在河口附近沿岸内湾潮间带沙滩或浅海细沙底质以及泥沙滩中,广泛分布于我国4个海区,是我国沿海常见的一种重要经济贝类,也是我国及我市出口创汇主要水产品之一。因此文蛤池塘养殖发展前景良好。但因文蛤池塘养殖产业起步晚,种苗来源杂,养殖技术不规范,导致养殖产品质量参差不齐、产量高低不一、病害爆发现象时有发生,严重影响出口创汇效益。为此,笔者从2001年开始对慈溪市文蛤池塘养殖有关情况进行了跟踪调查,对生产过程中的主要问题进行了相关研究。在开展文蛤幼苗培育技术研究的基础上,于2003年9月-2004年10月,在慈溪市龙山海水养殖区文蛤养殖基地进行了文蛤池塘养殖几种模式对比试验,并通过生产试验进行标准化生产技术研究。     

文蛤北方种群生化遗传结构与变异的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对文蛤5个北方种群进行了生化遗传分析。结果表明:文蛤5个天然种群的多态座位比例为0.475±0.064;平均杂合度为0.212±0.026,总体上遗传多样性较好,遗传变异水平较高。在各多态座位中有78.95%的座位符合Hardy-W e inberg平衡,有65.79%的座位d值为正,34.21%的座位为近交座位,存在近交,但近交程度不高。通过聚类分析可以初步判定,这5个群体同属于一个种,种群间由于地理隔离已形成了不同的地理种群。     

不同地理种群文蛤的营养成分研究

对辽宁、山东、江苏、广西4个不同地理种群文蛤的营养成分进行了研究分析。结果表明:蛋白质含量以山东文蛤种群最高(56.07%);粗脂肪和水分以及多糖含量以广西文蛤种群最高,分别为6.78%、7.00%、16.95%;灰分含量以江苏文蛤种群最高(19.79%)。氨基酸的组成非常全面,各地理种群文蛤干物质中必需氨基酸含量由大到小的变化顺序依次为广西(38.18%)、江苏(37.43%)、辽宁(37.38%)、山东(37.05%);各种群氨基酸总量由大到小的变化顺序为广西(495.815 mg/g)、江苏(495.305 mg/g)、山东(467.548 mg/g)、辽宁(463.752 mg/g)。呈鲜味的谷氨酸和天冬氨酸、呈甘味的甘氨酸和丙氨酸以及与甘味有关的脯氨酸和丝氨酸等6种氨基酸的含量较高,变化范围在209.8 mg/g~218.5 mg/g。     

文蛤病原菌——需钠弧菌的鉴定和生物学特性分析

从患病文蛤Meretrix meretrix体内分离出一优势菌株WT01,回归感染试验证明是文蛤的致病菌。对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和PH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明,该菌为革兰氏阴性菌,发酵葡萄糖产酸不产气,氧化酶阳性,生长需NaCl,无色素,不发光,在TCBS平板上形成圆形黄色菌落,对弧菌抑制剂O／129敏感,具有弧菌属的典型特征。16S rRNA基因序列分析表明,该菌与需钠弧菌Vibrio natriegen的亲缘关系最为接近,其同源性达999／6以上。因此,将该菌鉴定为需钠弧菌。实验显示其半数致死量为5．5×10^6CFU／g。19种抗菌药物药敏试验结果表明,该菌对氟哌酸、复方新诺明、菌必治、先锋必、链霉素、氯霉素和庆大霉素等抗生素较为敏感。并对其胞外产物的生物学特性进行了分析。