西农萨能羊胰岛素诱导基因2(INSIG2)的克隆及组织表达分析

胰岛素诱导基因2(insulin induced gene2,INSIG2)是参与脂质形成和代谢调控的重要基因,而山羊乳腺中脂质合成和代谢与乳品质密切相关。为进一步明确它们之间的关系进而为改善山羊乳品风味提供科学支持。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR技术克隆山羊INSIG2基因,并采用实时荧光定量(RT-qPCR)技术在山羊10个组织中对INSIG2基因进行了组织表达分析。研究获得了915bp的cDNA序列(GenBank登录号:JQ361767),其中编码区678bp,该基因编码225个氨基酸,预测蛋白质分子量为24.8730kD,等电点(pI)为8.77。通过核苷酸和氨基酸序列比对分析发现,山羊的INSIG2与GenBank中牛(Bos taurus)的相似性最高。蛋白质结构分析显示,INSIG2存在6个跨膜螺旋;疏水性分析发现,其N端和C端均具有亲水性;遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪(Susscrofa)。INSIG2基因的组织表达分析表明,INSIG2基因在10个被检测组织中均有表达,且肺组织中表达量最高,肌肉次之,乳腺组织的表达量居中,心脏组织中最低。研究结果为该基因在山羊乳腺组织中的功能研究提供依据。     

月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组...     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

棉酚是棉花重要的次生代谢产物之一,具有抗虫及抗病害的作用。法尼基焦磷酸合酶是杜松烯合酶的上游酶,催化合成法尼基焦磷酸,该物质是棉酚等次生代谢物生物合成的前体。本文依据亚洲棉法尼基焦磷酸合酶基因序列,采用同源RT-PCR技术,克隆了陆地棉法尼基焦磷酸合酶基因,对其序列和编码产物结构进行了分析。荧光定量PCR分析表明,该基因在棉花植株叶片表达量最高,根部最低,在花、铃、蕾、茎中的表达水平接近。以上工作为棉花异戊二烯基途径的分析及相关次生代谢的途径工程研究奠定了一定的理论基础。     

海藻糖合酶基因的克隆及转化甘蔗的研究

从提子菌灰树花的菌丝体中提取总ＲＮＡ,并纯化出ｍＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到一长约２．２ｋｂ的片段,经测序,其全长２１９９ｂｐ,包括起始密码和终止密码;随后将此片段插入植物表达载体ｐＢＩ１２１的３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子之间,构建了一植物表达载体（ｐＢＴ）,又将此片段加上ｕｂｉ－Ｌ启动子和ＮＯＳ终止子构建了另一植物表达载体（ｐＵＢＴ）,然后通过基因枪法分别用植物表达载体ｐＢＴ和ｐＵＢＴ转化甘蔗,     

大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因的克隆

根据报道的大肠杆菌（Escherichia coli)海藻糖－6－磷酸合酶基因（otsA)，设计引物，通过PCR技术从大肠杆菌XLI菌株的总DNA中扩增到一个1．4kb片段。经克隆、测序分析，该片段长1425bp并含一完整的开放读框（ORF）。在核苷酸水平上，该ORF与已报道的otsA基因具有99．86％的同源性。在氨基酸水平上，其推断性的编码产物蛋白与OtsA具有100％一致性。     

低氮胁迫下大麦谷氨酰胺酶基因的表达分析

谷氨酰胺酶是氮代谢中的关键酶,在氨同化和谷氨酰胺生物合成中起着重要的作用。为研究谷氨酰胺酶基因在大麦耐低氮中的作用机理,本研究利用荧光定量PCR技术检测了大麦中这两类谷氨酰胺酶基因（GS1和GS2）在低氮胁迫下的表达情况,并分析了谷氨酰胺酶基因在耐低氮大麦基因型BI-04和低氮敏感大麦基因型BI-45间的表达差异。结果表明,GS1基因在BI-04中表现为上调表达,而在BI-45中表现为下调表达,但随着时间的延长其表达量恢复并超过对照;而GS2基因在两种大麦基因型中的表达差不多,都表现为下调表达。另外,本文也观察到大麦谷氨酰胺酶基因的表达在黑暗条件下受到抑制,因此推测其也受到光照条件的影响。     

无花果曲酶植酸酶基因phyA的克隆、序列分析及表达*

用RT-PCR方法从无花果曲酶(Aspergillus ficuum3．4322)中扩增出1条约1．4kb的特异性条带，并将其克隆到pMD18-T载体中。DNA序列测定表明，目的片段为不含信号肽的植酸酶编码序列，全长1347bp，编码448个氨基酸。该基因序列已在GenBank注册(注册号为：AF537344)。将该基因克隆到酵母表达载体pYES2中，构建成不带信号肽phyA基因的重组表达载体pYPA2。用醋酸锂法将pYPA2转进Ura缺陷型的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisine INVSc1)，筛选获得含植酸酶基因的酵母转化子。经半乳糖诱导表达后，用磷钼蓝显色(AMES)法对酵母菌体进行酶活性测定，测出了明显的植酸酶活性，pYPA2胞内植酸酶活性约11．55U／L，表明无花果曲酶phyA基因能在酿酒酵母中表达。     

藜麦β-香树酯醇合酶和鲨烯合酶基因的克隆与表达

为了探明藜麦皂苷生物合成的分子机制,试验以藜麦品种陇藜1号为材料,利用已有的转录数据,通过RT-PCR技术鉴定参与三萜皂苷生物合成关键酶基因,采用生物信息学分析方法进行了基因编码蛋白保守结构域、蛋白二级结构及系统发育树的构建,并利用半定量RT-PCR方法进行了目的基因在籽粒不同发育时期和植株不同部位(根、茎、叶和籽粒)表达水平的研究。试验克隆得到三萜烯皂苷生物合成途径中关键酶编码基因CqSS1、CqSS2和CqbAS的cDNA全长序列。半定量RT-PCR表达分析表明,CqSS1和CqbAS在叶片、籽粒中表达量最高,各基因在籽粒不同发育时期的表达量间无显著差异。本研究对藜麦三萜皂苷生物合成途径中关键酶基因表达模式的研究,将为进一步探明藜麦皂苷生物合成的分子机制及发掘影响藜麦皂苷含量的关键基因奠定基础。     

Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putida GM6为研究材料.为获得其多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,ppk）基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段（约528 bp）.随后采用快速染色体步移方法（Self-formed adaptor PCR,SEFA-PCR）技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp（GenBank accession number DQ133537）.构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E. coli BL21（DE3）/ pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物.且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%（对照菌株的磷去除率仅为18%）,远高于已报道的40%的去除率.这表明ppk基因在E. coli中的过量表达,导致了E. coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐.     

盐地碱蓬SsDREB基因的克隆与表达分析研究

盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）是典型的盐碱地指示性植物。本研究以盐地碱蓬为材料,根据其他植物中干旱应答元件结合蛋白保守区的氨基酸序列设计简并引物,通过PCR扩增到一条长180bp的cDNA片段,继而利用RACE技术克隆了一个盐地碱蓬DREB基因全长cDNA,命名为SsDREB。SsDREBcDNA全长为14...     

甘蓝非编码RNA基因BoNR1的克隆与表达分析

非编码RNA是近年来新发现的一类在生物体内广泛存在、能够在生命活动中行使重要功能的特殊基因。根据普通白菜花粉特异的非编码RNA基因BcMF11的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从甘蓝中克隆出BcMF11的同源基因BoNR1,该基因全长798bp,缺乏明显的开放阅读框,而且在序列中多处出现终止密码子。生物信息学...     

棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD3的克隆及原核表达

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。本研究从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD3(GenBank登录号为FJ376601)。GhCAD3全长1573 bp,具有1个1080 bp的开放阅读框,5′非编码区为35 bp,3′非编码区为458 bp,编码359个氨基酸,预测分子量约为39.116kD,等电点为7.48。氨基酸同源性分析发现,GhCAD3与其他CAD一致性为64.13%。为了进一步研究GhCAD3基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-CAD3,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导7 h。     

牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建

以牡丹品种赵粉（Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen）为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5＇非编码区、302bp的3＇非编码区...     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

青花菜BoCHS2基因的克隆、表达和反义载体的构建

根据前期的研究结果设计PCR引物,从青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片基因组DNA和cDNA中克隆到了查尔酮合成酶基因,定名为BoCHS2.BoCHS2的基因组DNA全长为1267bp,具一个长度为85bp的内含子,基因编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸.基因序列已提交至...     

紫菜薹快速碱化因子基因BcMF14p的序列与表达分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子。根据已知的普通白菜两用系中可育株系特异表达的快速碱化因子基因BcMF14序列,在其编码框两侧设计引物,从紫菜薹中克隆出该类信号分子基因,命名为BcMF14p(登陆号:EF523517),全长273 bp,不含内含子,编码框包含222个核苷酸,编码73个氨基酸。NCBI在线同源比对结果表明该基因属于快速碱化因子家族,与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子核苷酸序列相似性达到86%以上。对该信号分子的表达进行RT-PCR分析,结果显示BcMF14p只在紫菜薹花蕾、花、角果等生殖器管中表达,在茎、叶等营养器官中不表达,说明BcMF14p可能参与紫菜薹生殖发育过程中的信号传导。     

小麦RPL21基因同源克隆与表达分析

为了解60S核糖体蛋白L21(ribosomal protein L21,RPL21)的基因组结构和表达模式,以GenBank数据库中小麦RPL21基因的部分序列为信息探针,采用RT-PCR和PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆了RPL21基因的cDNA与DNA片段,并对该基因在小麦多子房近等基因系间的表达差异和多子房...     

水稻SUSIBA2-like基因的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了水稻中淀粉去分支酶1(isoamylase1,ISA1)和SUSIBA2-like基因的cDNA序列,全长ORF分别编码了811个和572个氨基酸残基。生物信息学分析显示SUSIBA2-like与SUSIBA2氨基酸同源性为80.7%,同属于第1类WRKY转录因子家族,且三级结构相似,可能具有相同的功能。半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在灌浆期12d胚乳中的表达量达到了1个峰值,在叶、根、茎中不表达;SUSIBA2-like基因也在灌浆期12d胚乳中的表达量达到了1个峰值,在根中没有检测到表达,在叶、茎中有表达。