高效除磷工程菌Pseudomonas putida GM6-PPK1的构建及其除磷能力研究

ppk1 基因编码的多聚磷酸盐激酶主要负责多聚磷酸盐的合成,其表达量的高低直接决定聚磷菌的聚 P 能力的强弱.Pseudomonas putida GM6 是从 EBPR 好氧池活性污泥中分离获得的一株具有聚 P 能力的菌株,该菌株含有两个编码多聚磷酸盐激酶的基因(ppk1 和 ppk2).通过 PCR 从高效聚磷菌株总 DNA 中扩增得到了 ppk1 及其启动子,并定向克隆到 pBBRMCS-5 载体上,构建了重组质粒 pMEPE-PPK,在辅助质粒 pRK2013 的帮助下,通过三亲接合将 pMEPE-PPK 转移到原始菌株 GM6 中,获得的工程菌 P. putida GM6-PPK1.GM6-PPK1 除 P 能力较原始菌株 GM6 和对照菌株 GM6-P5 提高了 54%,生长能力较原始菌株也有一定增强.通过模拟 EBPR 工艺,发现 GM6-PPK1 在厌氧/好氧交替的环境条件下强化表达不但提高了菌体好氧段的吸 P 能力,而且厌氧段 P 的释放和 PHA 的合成较之原始菌株也有显著增加.     

Pseudomonas putida GM6在活性污泥中的生物强化除磷

The enhanced biological phosphorus removal （EBPR） method is widely adopted for phosphorus removal from wastewater, yet little is known about its microbiological and molecular mechanisms. Therefore, it is difficult to predict and control the deterioration of the EBPR process in a large-scale municipal sewage treatment plant. This study used a novel strain isolated in the laboratory, Pseudomonas putida GM6, which had a high phosphate accumulating ability and could recover rapidly from the deteriorated system and enhance the capability of phosphorus removal in activated sludge. Strain GM6 marked with gfp gene, which was called GMTR, was delivered into a bench-scale sequencing batch reactor （SBR） of low efficiency, to investigate the colonization of GMTR and removal of phosphorus. After 21 days, the proportion of GMTR in the total bacteria of the sludge reached 9.2%, whereas the phosphorus removal rate was 96%, with an effluent concentration of about 0.2 mg L^-1. In the reactor with the addition of GMTR, phosphorus was removed quickly, in 1 h under anaerobic conditions, and in 2 h under aerobic conditions. These evidences were characteristic of EBPR processes. Field testing was conducted at a hospital sewage treatment facility with low phosphorus removal capability. Twentyone days after Pseudomonas putida GM6 was added, effluent phosphorus concentration remained around 0.3 mg L^-1, corresponding to a removal rate of 96.8%. It was therefore demonstrated that Pseudomonas putida GM6 could be used for a quick startup and enhancement of wastewater biological phosphorus removal, which provided a scientific basis for potential large-scale engineering application.     

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)GM6的聚磷特性研究

从城市污水处理厂好氧池活性污泥中分离获得一株高效聚磷菌株GM6，经生理生化和16SrDNA初步鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）。GM6生长pH在5．5至8．5之间，最适生长pH为6．5；当pH值为7．0时，聚磷能力最强，pH值小于5．5或大于7．5时，除磷能力明显下降。通气量试验表明，装液量对GM6的生长影响较小；装液量为100ml时，磷的去除效果最好，当装液量大于150ml时磷的去除效果变差。GM6的最适生长温度为27℃，当温度小于5℃或大于37℃时生长较慢；当温度为20℃其除磷效果最好，温度大于33℃或小于5℃时，除磷效果明显变差。好氧条件下GM6在合成废水、MOPS培养基、LB及YG培养基中培养时磷的绝对去除量分别为9．87、12．1、87．3和67．1mgL^-1，磷的去除率分别为96．6％、85％、71．6％和63％，磷的绝对去除量和去除率远高于E．coli。好氧培养时菌体吸磷能力测定结果表明，GM6在合成废水、MOPS、LB及YG培养基中培养24h的菌体干重含磷量在6．80％～9．32％之间，而对照菌体含磷量在0．98％～2．31％之间，聚磷菌的聚磷效果远高于对照菌。用序批式反应器对GM6进行厌氧好氧纯培养时，厌氧末的上清液磷浓度为16．8mgL^-1，CODCr为230mgL^-1，放磷速率为4．5mgL^-1h^-1；好氧末的上清液磷浓度为2．56mgL^-1，CODCr为40mgL^-1，好氧吸磷速率为2．73mgL^-1h^-1，菌株GM6表现出了明显的好氧吸磷、厌氧放磷现象，具有聚磷菌的典型特征。     

Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putida GM6为研究材料.为获得其多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase,ppk）基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段（约528 bp）.随后采用快速染色体步移方法（Self-formed adaptor PCR,SEFA-PCR）技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp（GenBank accession number DQ133537）.构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E. coli BL21（DE3）/ pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物.且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%（对照菌株的磷去除率仅为18%）,远高于已报道的40%的去除率.这表明ppk基因在E. coli中的过量表达,导致了E. coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐.     

发光酶基因(luxAB)标记的荧光假单胞菌CP1108的定殖能力研究

利用三亲本杂交方法,将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CP1108上,研究标记菌株CP1108L的个体生态学特征及其在棉花根圈的定殖动态.结果表明,标记菌株连续传代20次均未发生质粒丢失现象,标记质粒在受体菌株中较为稳定,CP1108L菌株的生长及部分生理生化特性...     

内生菌YN201728的定殖能力及其防治烟草白粉病的效果研究

为研究生防菌YN201728在烟草体内的定殖规律及防病机制,本研究利用其绿色荧光标记菌株YN28-P43GFPmut3a实时动态观测标记菌的定殖部位及密度,并探究其对温室烟草白粉病的盆栽防效与定殖的关系。结果表明,YN28-P43GFPmut3a发酵液处理烟草种子和幼苗后,种子内的标记菌含量可达2.18×10⁶ CFU·g^-1,在幼苗的根表土、根际土、根、茎、叶等组织中均能检测到标记菌,且其定殖密度表现为根表土>根际土>根>茎>叶。激光共聚焦显微镜观察显示,标记菌主要聚集在烟草根表皮、木质部导管、茎表皮、韧皮部及维管束组织、叶片表面和叶肉细胞间隙以及种皮与胚等部位。盆栽防效试验结果表明,YN201728野生型和标记菌株对烟草白粉病均有较好的保护和治疗效果,持效期长达21 d。此外,烟草叶片中内生菌的定殖量与其防效呈正相关。本研究结果表明,内生菌YN201728在烟草体内有良好的定殖和防治白粉病效果,具很好的开发潜力,为烟草病害的生物防治提供了一定的理论基础。     

巨大芽胞杆菌WY4的GFP标记及其在小白菜上的定殖

解磷菌(phosphate solubilizing bacteria,PSB)可以通过提高土壤有效磷含量而增加作物产量,目前已有许多解磷菌被分离并应用于农业生产中,但关于解磷菌在植物根际中的定殖情况仍缺乏系统性的研究.WY4为本实验室前期从小白菜(Brassica chinensis)根际分离得到的一株高效解磷菌,本研究利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记技术研究了WY4在小白菜根际及土壤中的定殖规律.与原菌株相比,GFP标记对菌株WY4-GFP生长及解磷活性具有较小影响,同时在促进小白菜生长上WY4-GFP与WY4无显著性差异;WY4-GFP具有持久的定殖能力(接种21d的自然土及30 d的小白菜根际土中,WY4-GFP的定殖数量分别为105和104 CFU/g左右),同时随时间的增加WY4-GFP在土壤中定殖数量逐渐减少;WY4-GFP在小白菜根冠及分生区大量定殖,在伸长区及侧根根毛处数量较少,同时表皮细胞间隙上也有较多的标记菌株.研究结果表明,WY4-GFP在小白菜根际及土壤中具有良好的定殖能力,这为后期深入研究解磷菌与植物间的关系提供了重要参考.     

披碱草根际促生菌筛选及其接种剂的促生作用

【目的】体外促生能力是衡量微生物菌株作用的一个重要指标,测定获取的植物根际促生菌并明确其对披碱草的促生效果,可为其在生产中的应用提供依据。【方法】2014年9月从西藏阿里地区采集披碱草根系及根际土壤,以常规方法分离出其中的溶磷菌、 固氮菌和分泌3-吲哚乙酸(IAA)细菌的10株菌株。测定其溶磷量、 固氮酶活性及分泌生长素能力,并将其制成植物根际接种剂,测定接种剂对披碱草生长的影响及其在根际的定殖能力。【结果】菌株PWXZ10溶磷能力较好,达40.89 mg/L; 菌株003PWXZ6固氮酶活性较强,达421.21 nmol/(mL·h); 菌株NXP17分泌生长素能力较强,达31.33 μg/mL。与对照菌株(Pseudomonas sp. Jm92)相比,菌株003PWXZ6和NXP17制备的接种剂可显著增加披碱草株高、 地上生物量和地下生物量(P0.05),但两者之间差异不显著(P0.05); 接种剂003PWXZ6对披碱草根总长、 根表面积、 根体积、 根直径、 含磷量、 含氮量和粗蛋白含量增加显著(P0.05),分别较对照菌株(Pseudomonas sp. Jm92)增加了330%、 199%、 118%、 187%、 70%、 15%和19%,并且该菌株在根际定殖能力很强。 【结论】植物根际促生菌003PWXZ6和NXP17对披碱草具有良好促生效果,可为开发经济环保的生物肥料提供了菌种资源。     

Na+和K+共存对A2/O工艺脱氮除磷效果及污泥性质的影响

为了揭示多种金属离子共存的含盐废水生物处理系统污染物的去除机制和污泥特性,考察Na~+、K~+共存对A~2/O工艺污染物去除率、污泥性质和微生物群落的影响,采用高通量测序技术分析了厌氧区、缺氧区和好氧区的微生物群落结构,结合脱氮除磷效果和污泥性质的变化,探讨不同Na~+/K~+摩尔比下A~2/O工艺优势种群的演替规律,以期从微生物角度明确Na~+、K~+共存对含盐废水污染物去除率的影响。结果表明:当进水Na~+/K~+摩尔比分别为2、1和0.5时,A~2/O工艺的COD去除率分别为80%、84%和86%,TN去除率分别为73%、77%和80%,K~+浓度的提高缓解了Na~+对COD和TN去除率的抑制作用;厌氧区释磷率分别为70%、73%和74%,缺氧区吸磷率分别为53%、55%和58%,好氧区吸磷率分别为70%、72%和75%。随着进水Na~+/K~+摩尔比的降低,厌氧区、缺氧区和好氧区微生物群落的丰富度和多样性降低,微生物群落差异显著,变形菌门的相对丰度均升高约30%,拟杆菌门和绿弯菌门相对丰度逐渐降低。陶氏菌属和固氮弧菌属作为优势菌属,其相对丰度逐渐增大,有利于氮磷污染物的去除。通过增加K~+的浓度有利于提高氮、磷去除率,增强污泥的生物絮凝性和反硝化聚磷菌的活性。     

缩二脲降解菌在作物根际的GFP标记示踪

通过三亲结合对缩二脲降解菌GW-1菌株成功进行了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）基因标记,标记菌株命名为GW-1-GFP。实验证明外源质粒对宿主菌的生长未带来不利的影响,且经高效液相色谱测定该标记菌株降解缩二脲的能力与出发菌株无显著差异（p<0.05）。经抗生素抗性和荧光追踪证明标记菌株GW-1-GFP能够很好地在土壤中定殖,第25天时在不同处理的土壤中标记菌株对缩二脲的降解能力都超过50%,45天后该标记菌株在土壤中已难以检测。经标记菌株GW-1-GFP菌悬液浸润的小麦种子发芽后,通过荧光观察显示降解缩二脲的标记菌株GW-1-GFP在小麦根部定殖良好,且该标记菌株能在一定程度上缓解缩二脲对小麦的毒害作用。该研究为验证、追踪土壤中功能微生物菌剂与作物根部的亲和性和生态有效性提供了简易、直观的检测方法。